与色谱柱相关的问题汇总（二）

  11.关于色谱柱的填装问题!我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：

　　①国外生产填料并填装完成成品卖到国内;

　　②国外生产填料，国内填装销售;

　　③国内生产填料，国内填装销售。

　　一般情况下，第1种情况卖的最贵，也质量最好!可是我就不明白了：如果是填料的生产很复杂的话，那么填装上国内也跟不上去吗?为什么换在国内填装就会出现或多或少的一些小问题呢?

　　答：国内填装会出现质量小问题，和国内目前普遍做事没有国外严谨有关吧。如果工艺技术上没有问题，又能制订并切实执行一整套严格的生产质量管理措施，国内填装和国外填装并无区别。

　　12.国产色谱柱在市场上占有比例如何啊?

　　答：国内色谱柱市场还没有人进行过科学统计，连一年色谱柱销售总量也众说纷云，更别说国内生产色谱柱所占份额了。我估计是占30%左右吧。

　　13.预柱或保护柱用还是不用的问题!原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响样品分析吗?我们做的大多是头孢类的抗生素。

　　答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接得好并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。

　　头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱(中间是个筛板)，制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是最好配个保护柱。

　　14.用的是四元梯度泵：A：50%甲醇;B：50%水， 经常出现停或进气泡这是什么原因?

　　答：水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比较高的，但，影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱?系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。

　　15.填料方法的前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明?

　　答：资料显示：在正常条件下，填料粒度>20µm时，干法填充制备柱较为合适;颗粒<20µm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种

　　① 高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充;

　　② 径向加压法，WatersZL;

　　③ 轴向加压法，主要用于装填大直径柱;

　　④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。为什么以20μm为分界点?

　　16.想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法，是不连检测器吗?

　　答：反冲就是将柱子反向连到系统中。因为，有污染物反冲出来，当然不连检测器，出液端直接接到废液瓶就可以。

　　17.如果不使用不锈钢接头，而改用peek头，是否可以完全解决接头匹配问题?

　　答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，VICI，Upchurch，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。

　　18.有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径(2～5μm)的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。那么，你们在使用说明书中会说明前后筛板的孔径吗?

　　答：如果前后筛板孔径不对称，厂商肯定也会在说明书里特别提到的。

　　19.我在做多肽药物时遇到下列问题：

　　1)基线不稳定波动大，流动相 A ：

　　1%TF，A：水溶液，B：1%TFA乙腈溶液检测波长210nm流速1.0mL/mL 什么原因?怎么解决?TFA有什么作用?流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。

　　2)做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好;

　　3)药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为30nm，30nm与10nm对结果有什么区别?

　　答：应该是起“离子对”的作用吧。在做多肽类样品的时候，300A孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。流动相加入TFA，在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸(TFA)作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。

　　※三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

　　20.waters，Atlantis C18柱可以用较高比例的流动相，那麽用完后应该怎麽清洗?在什麽体系中保存比教合适?

　　答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：

　　流动相中不含缓冲盐：

　　分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向冲洗色谱柱45min

　　流动相中含有缓冲盐：

　　分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向冲洗色谱柱45min;(注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易长菌，使用时间不可超过3天);

　　水性柱保存体系也不特别：

　　短期保存在所用的流动相中(不含缓冲盐)，中长期保存在纯甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。