两种测定抗体效价方法的实验原理和操作步骤

酶联免疫吸附实验法

一、实验目的
1. 深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2. 掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。

二、实验原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了未反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA法中，酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。

目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30min后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。

三、仪器、原料和试剂

仪器：聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫仪、水浴锅。
原料：单克隆抗体
试剂：
1. 抗原及酶标记抗体
　①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG)；
　②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP)；均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
2. 洗涤液(含0.05%Tween 20的PBS)：1L PBS中加入Tween-20 500μL。

3. 封闭液(含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween-20的PBS)：10mL PBS中加入100mgBSA，10μLTween-20。

4. 底物溶液
　①磷酸钠盐缓冲液(0.1mol/LpH6.0)：称Na₂HPO₄·12H₂O2.2g，NaH₂PO4·2H₂O 6.84g，用蒸馏水溶解，定容至500mL。
　② TMB 贮液：称60mgTMB溶于10mL二甲基亚砜中，4℃避光保存。
　③底物应用液：现用现配，磷酸钠缓冲液10mL，TMB 贮液10μL。30%H₂O₂ 15μL，混匀。
5. 终止液：2mol/LH₂SO₄
四、操作步骤
　①抗原包被：兔抗人IgG作为抗原，用包被液l:8000稀释，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中。4℃放置过夜。
　②洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。
　③封闭：加l00μL/孔封闭液，室温放置0.5h。

　④洗涤：用洗涤液洗3次。
　⑤加待测样品(一抗)：将含单克降抗体的细胞培养上清在另一块板上用PBS 连续稀释(按照1:2或1:10)，100μL/孔加到已包被的板上，每个样品平行做两份，PBS或空白培养基作为阴性对照，已知样品作为阳性对照。加盖37℃恒温箱温育1~2h。
  ⑥洗涤：用洗涤液洗3次。
　⑦加酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液l :8000稀释，100μL/孔，加盖37℃恒温箱温育1h。
　⑧洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。
　⑨显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5~30min，显示蓝色。
　⑩终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm 处各孔的吸光值，阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。
试管凝集实验（Tube agglutination test）------抗体效价测定
【原理】
大分子颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与其相应的抗体相结合，在适量的电解质存在及一定的温度下，经过一定的时间可出现肉眼可见的凝集团块，是为凝集反应。

试管凝集实验的应用，一般均以标准抗原（已知抗原）测定免疫血清或患者血清中抗体的效价。

【材料】
1:10抗羊红细胞免疫血清（配制前需经56℃30min灭活）
1%绵羊红细胞生理盐水悬液
生理盐水
试管及1ml刻度吸管
试管架及吸液橡皮乳头、红蜡笔
恒温箱
【方法】
　1. 取试管8支，排列于试管架上并做好标记。
　2. 每管各加入生理盐水0.5ml。
　3. 吸取1:10抗绵羊红细胞免疫血清（抗体）0.5ml加入第1管中并充分混匀。
　4. 自第1管中吸出0.5ml加入第2管中，经充分混匀后吸出0.5ml加入第3管中，如此依次稀释至第7管，混匀后吸出0.5ml弃去。此时1~7管所含免疫血清（抗体）的稀释度为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280，第8管不加免疫血清做为对照。
　5. 1~8管每管各加1%绵羊红细胞悬液（抗原）各0.5ml。（注意：加入前必须将红细胞悬液充分混匀）。
　6. 此时第1~7管的血清（抗体）最终稀释度为1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560。
　7. 摇匀后，静置于37℃下，1小时后观察结果并写出实验记录。
【结果】
　1. 观察前切勿摇动试管，以免凝集分散。
　2. 首先应观察对照管，该管因无相对应的免疫血清故不应有凝集现象，血球应全部沉于试管底部呈规则园盘状。如出现凝集现象则说明实验操作有误或血球本身有自凝现象，试验结果不能成立。
　3. 再观察1~6试验管，并以++++、+++、++、+分别表示凝集强度，不凝集者记以“-”。
　　++++：完全凝集，呈厚膜状铺于管底，边缘呈锯齿状。
　　+++：血球呈薄层贴于管底，边缘不齐。
　　++：中央呈较小园盘状沉淀，边缘凝集呈颗粒状。
　　+：血球呈较大的园盘状沉淀，边缘有少量凝集颗粒。
　　-：无凝集，血球沉于管底园盘状。
　4. 以血清最高稀释度仍能出现“++”凝集现象者，作为该免疫血清的效价（滴度）。

抗体效价测定结果

例如，在本次实验中第5管（1:640）呈“++”凝集，第6管（1:1280）呈“+”凝集或“-”，对照管为“-”，则该血清的效价为1:640。

注：
1. 免疫血清在实验前须经56℃30min灭活，是指对免疫血清中所含补体活性的灭活，如不灭活处理则直接影响凝集结果，例如在本次实验中高浓度的免疫血清可使血球出现溶解现象。

2. 本次实验对凝集反应判读结果的方法，仅属对红细胞凝集的判读，而对其它颗粒性抗原（如细菌菌体抗原）在凝集反应中判读结果的方法则在微生物学实习指导中另有说明。