(一)原理
亲和层析是一种吸附层析,抗原(或抗体)和相应的抗体(或抗原)发生特异性结合,而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原(或抗体)固相化后,就可以使存在液相中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上,借以与液相中的其他蛋白质分开,达到分离提纯的目的。
此法具有高效、快速、简便等优点。
(二)载体的基本要求和选择
理想的载体应具有下列基本条件:①不溶于水,但高度亲水;②惰性物质,非特异性吸附少;③具有相当量的化学基团可供活化;④理化性质稳定;⑤机械性能好,具有一定的颗粒形式以保持一定的流速;⑥通透性好,最好为多孔的网状结构,使大分子能自由通过;⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中,皂土、玻璃微球等吸附能力弱,且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。
琼脂糖凝胶的优点是亲水性强,理化性质稳定,不受细菌和酶的作用,具有疏松的网状结构,在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时,对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化,活化后性质稳定,能经受层析的各种条件,如0.1Mol/L
NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理,不引起性质改变,故易于再生和反复使用。
琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose,含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松,而吸附容量比2B大,所以4B应用最广。
(三)试剂与配制
1.Sepharose 4B
2.CNBr(剧毒)
3.抗原或抗体
4.1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5.0.1Mol/L NaHCO3
6.2Mol/L NaOH
7.0.01Mol/L pH7.4 PBS
0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml
0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml
NaCl 32.76g
加水至4 000ml。
8.0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml,取此液,加0.2Mol/L HCl84ml加水166ml共500ml。
9.7Mol/L尿素
10.0.2Mol/L NaHCO3,(含0.1Mol/L NaCI)
1Mol/L NaHCO3 100.00ml
NaCl 2.93g
加水至500.00ml。
四)实验方法
1.琼脂糖活化
⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤,立即转入100ml烧杯中,冰浴置于磁力搅拌器上。
⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入琼脂糖中,小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右,反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0~11.0维持10min。
⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
2.偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。
⑴ 事先将需偶联的抗原(或抗体)蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。
⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min内,从抽洗到偶联),4℃缓慢搅拌过夜,使蛋白与活化的琼脂结合。
3.装柱
⑴ 选柱:不宜过大,一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。
⑵ 装柱:将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内,拧紧下口夹,让其下沉,数分钟后松开下口夹,使溶液约以1ml/min的速度流出。
⑶ 洗柱:以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3(含0.1Mol/L NaCl)洗涤至洗出液的OD280<0.02 为止。
收集全部的洗脱液,测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量,由此可计算偶联率。
4.吸附与解吸附
⑴按床体积1/10加样,浓度为1%~2%,缓慢加入待纯化的抗体(或抗原),用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱,流速为1ml/min,至洗出液OD280<0.02为止。
⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸-HCl缓冲液,流速1ml/min,收集解吸附下来的成分,立即以1Mol/L NaHCO3中和,以免蛋白变性。
5.以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤,再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤,平衡后,可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。
6.结果判定
⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。
⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并,以生理盐水透析,然后浓缩或冻干保存。
亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中,特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合,产生复合......
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