亲和层析的原理

4 亲和层析
4.1 原理 亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理,将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统.这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别.常用的生物亲和关系有酶-底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子,抗体-抗原,激素-受体蛋白、载体蛋白,外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体,核酸-互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等 〔10,11〕 .
4.2 离子交换剂 亲和层析的层析剂可分为3个部分:
（1）载体,载体起支架作用,一般是偶联凝胶或多孔玻璃珠.
（2）间臂,由于生物大分子的空间位阻作用,需加一间臂,其长度具有重要作用.太长则增加了非特异性疏水吸附作用,太短则起不到应有的作用.
（3）配基,这是亲和层析的核心物质,在分离中起特异性吸附欲分离物的作用.配基一般分为天然配基（包括糖结合配基和蛋白质结合配基）、染料配基、氨基酸类亲和配基、核苷酸及核苷酸类似物配基和仿生配基等几类.其中利用计算机辅助设计的仿生配基 〔12～15〕 和膜层析 〔16〕 代表了亲和层析的发展方向.不仅是配基本身的结构,它们与载体的连接方法也与层析的分离能力有关 〔17〕 .
4.3 影响因素与洗脱 亲和层析中配基与欲分离物吸附作用的大小主要与配基的空间结构有关,因此可以用分子间相互作用的平衡常数K D 来衡量亲和作用强度 〔18〕 .但它们的结合力仍不外乎对应的功能基团之间的氢键、静电作用、疏水作用等.所以,除了可改变配基以改变亲和层析的作用强度以外,还可以通过改变pH和离子强度的方法来改变配基与生物大分子之间的亲和力,从而达到洗脱的目的 〔19〕 .但由于亲和层析的多样性,洗脱的条件常常需要通过实验来获得.除此以外,还可运用其它配基、抑制剂等物质与出层析剂上的配基或生物大分子产生竞争性结合,达到洗脱的目的,这种方法被称为专一性洗脱.专一性洗脱可以获得很高的分辨能力,但洗脱剂的价格较高,所以常与普通洗脱配合使用.值得注意的是,在洗脱时,会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来,因此常在其后加一凝胶层析以除去小分子的配基.
4.4 应用及举例 在实际使用中,配基与欲分离蛋白质之间的亲和力要控制在一定的范围之内,这是因为若亲和力太低,则分离的效果不好;若亲和力太高,则洗脱太困难.因此配基与欲分离蛋白质之间的K D 值一般控制在10 -4 10 -6 之间