亲和层析法去除交叉反应性抗体实验

缓冲液和溶液 细胞裂解缓冲液 NaOH Tris-缓冲盐溶液 TBS Triton X-100 溶菌酶 胰 DNA 酶 I 制备用于文库筛选的抗体 大肠杆菌培养液

离心和转子 亲和层析柱 溴化氢活化的 Sepharose 4B

材料

缓冲液和溶液

贮存液，缓冲液和试剂的组分请见附录 12
将贮存液稀释到适当的浓度。

细胞裂解缓冲液
0.1mol/L 醋酸钠
1mol/L NaCl
用 0.45um 滤膜过滤细胞裂解缓冲液，室温贮存。每 1L 培养细菌需要大约 100 ml 细胞裂解缓冲液。

NaOH(1mol/L)

Tris-缓冲盐溶液（TBS) 和含 0.2%(m/V) 叠氮化钠的 TBS

Triton X-100

酶和缓冲液

溶菌酶
使用分子生物学级的溶菌酶。加入固体洧菌酶以辅助裂解细菌。

胰 DNA 酶 I
在细胞裂解液中加入固体 DNA 酶 I 消化染色体 DNA。

抗体

制备用于文库筛选的抗体
利用蛋白 A-Sepharose 亲和层析制备的 IgG 片段，本方案可获得最佳效果。用蛋白 Aipharoae 介质的亲和层析法，请见 Harlow 和 Lane 法（1999)。

培养基

培养液
需要 1 升合适的大肠杆菌培养液。

离心和转子

Sorval GSA 转子或相当转子
Sorval SS-34 转子或相当转子

专用设备

亲和层析柱
5 ml 塞有玻璃棉的塑料注射器或 Bi-Rad Poly-Prep 柱子均适用。

溴化氢活化的 Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech) 或 Affi-GellO(Bia Rad)

载体和菌株
大肠杆菌作为制备表达文库的宿主菌

方法

1. 将适当菌株（如 Y1090 hsdR、XLl-Blue 或 DH1) 的 1L 培养物培养至静止期。

2. 用 Sorvall GSA 转头（5000r/min) 于 4°C 以 4000 g 离心 20 min 收获菌体。

3. 弃去培养基，倒置离心管排出残留培养液。

4. 将沉淀物重悬于 100 ml 的细胞裂解缓冲液中。

5. 加入 200 mg 溶菌酶，于室温温育菌液 20 min。

6. 加入 1 mg 胰 DNA 酶, 和 200ul Triton X-100。

7. 于 4°C 温育菌液 1 h, 或温育至上清由混浊变清亮且黏度降低。

8. 将细菌裂解液于 4°C 以 8000 g(8200r/min 用 SorvallSS-34 转头）离心 20 min, 小心将上清液倒入另一个烧杯内。

9. 用 1mol/LNaOH 将上清液 pH 调至 9.0。

10. 用 Lowry,Bradford 或其他方法检测裂解液中蛋白的浓度。

11. 将提取液骤冷至 0°C, 并按操作说明将菌体蛋白质结合于溴化氢活化的Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10。

12. 使用前，用含 0.2%(m/V) 叠氮化钠的 TBS 平衡与大肠杆菌提取物结合的 Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10 树脂。

13. 每通过亲和层析纯化 1 mgIgG, 需要 1 ml 固定体积的与大肠杆菌抗原相偶联的树脂。IgG 和偶联的树脂混匀后，在转鼓中于室溫溫育 12~18 h。

14. 将匀浆液装到亲和层析柱上。用 TBS 洗脱抗体。收集洗脱液（每管 0.2 柱床体积）至OD280 降为 0。合并各管抗体，并将亲和纯化抗体贮存于-20°C, 以备免疫筛选时用。