人血小板活化因子(PAF)ELISA试剂盒
(用于血清、血浆、细胞培养上清液和生物体液内)
原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 PAF 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 PAF与单抗结合,加入生物素化的抗人PAF,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,最后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,PAF浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中PAF浓度。
试剂盒组成(2-8℃保存)
酶标板(Coated Wells) | 96孔 | 酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate) | 12ml |
10×标本稀释液(Sample Buffer) | 12ml | 20×浓缩洗涤液(Wash Buffer) | 50ml |
标准品(Standards):1000mU/瓶 | 2瓶 | 底物工作液(TMB Solution) | 12ml |
第一抗体工作液(Biotinylated Antibody) | 12ml | 终止液(Stop Solution) | 12ml |
准备试剂与收集血样
1. 收集标本:血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20 ℃或-70 ℃)保存,避免反复冻融。血清测定前用标本稀释液至少作1:20稀释(取10ul,加标本稀释液190ul,稀释20倍)。
2. 标准品液配制:使用前加入1ml蒸馏水混匀,配成1000mU/ml的溶液。设标准管8管,第一管加标本稀释液900ul,第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入1000mU/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
3. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。
4. 洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)
检测程序
1. 加样:每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2. 洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
3. 每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4. 洗板:同前。
5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6. 洗板:同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul,置37 ℃暗处反应15分钟。
8. 每孔加入100ul终止液混匀。
9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断
1. 所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.1、1.56、0 mU/ml为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。
3. 根据样品OD值在该曲线图上查出相应PAF含量,再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能
1. 灵敏度:最小的PAF 检测浓度小于1mU/ml。
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