核提取物的制备
核提取物制备优化
细胞质（S-100)组分的制备
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 转瓶或单层培养的哺乳动物细胞（如HeLa细胞） |
| 试剂、试剂盒 | PBS 低渗缓冲液 高盐缓冲液 含1. 2 mol L KCl 透析缓冲液 液氮 |
| 仪器、耗材 | 贝克曼 JS4. 2 转子或相当的转子 50 mL 圆锥形刻度聚丙烯离心管（对较小体积的提取物也可用 15 mL 的离心管） Dounce 氏玻璃匀浆器（B 型研杵） Beckman JA-20 离心转子或相当的转子磁性搅拌器或倾斜台 Beckman JA-20 离心转子或相当的转子磁性搅拌器或倾斜台、 管型透析膜（14000 MWCO）、电导计 |
| 实验步骤 | 1a) 收集转瓶培养的细胞：将 5× 108〜10× 108 细胞置 1 L 的塑料瓶 1850 g 离心 20 min。轻轻倒去上清并丢弃，将细胞转入50 mL 锥形刻度离心管中（每管 2〜3 L 培养液中的细胞）。进行步骤 2。 1b) 收集单层培养的细胞：单层细胞长满后去掉培养液。用足量 PBS 洗 1 次，PBS 用 量为没过细胞，轻轻振荡，弃 PBS。将细胞刮入新鲜 PBS 液里，倒进锥形刻度离心管中。进行步骤 2。 2) 1850 g 离心 10 min。进行步骤 3a 转瓶培养或步骤 3b 单层培养。 3a) 转瓶培养细胞：轻轻倒出上清并弃掉。用离心管上的刻度测量压紧后细胞的体积 (Pcv)将细胞重悬于约 5 倍于其 pcv 的 PBS 液中。1850 g 离心10 min。进行步 骤 4。 3b) 单层培养细胞：轻轻倒出上清并弃掉。用离心管上的刻度测量 pcv, 进行步骤 4。 4) 快速地将沉淀的细胞重悬于 5 倍体积的低渗缓冲液中1850 g 离心 10 min 并弃掉上 清。 5) 将细胞沉淀重悬于 3 倍于原 pcv 的低渗缓冲液中，放置在冰上 10 min，让细胞肿胀。 6) 将细胞转到 Dmmce 氏玻璃匀浆器中，用 B 号研杵上下抽提 10 次。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检査细胞裂解情况（应大于80%〜90%)。 7) 将细胞转到离心管中。用 JS4.2 转子 3300 g 离心 15 min 收集细胞核。保留上清用来制备 S-l00 细胞质提取物。 8) 用离心管上的刻度测量第 7 步离心压紧后的细胞核体积（pnv)。用 l/2 pnv 体积的低盐缓冲液重悬细胞核。 9) 在轻轻搅拌的同时，逐滴加入1/2 pnv 体积（见步骤 8) 的高盐缓冲液。必要时用 Dounce 氏玻璃匀装器混匀。 10) 不断轻轻搅拌 30 min 以提取核内容物。 11) 用 Beckman JA-20 转子 25 000 g 离心 30 min 以收集核提取物。倒出上清并测量其电导率（见步骤 12)，这就是核提取物。 12) 将核提取物加入透析管中，用夹子至少封住透析袋的一端；透析袋一端是打开的， 这样就可以测量透析袋内核提取物的电导率，比较核提取物电导率和透析液电导率 的不同，以确定是否需要进一步透析。在 50 倍体积的透析液中进行透析，直到提 取物的电导率和透析液一致为止（即提取物的 KCr 浓度达到 100 mmol/L 时）。尽量缩短透析时间。 取 5〜10 μl 提取物用水稀释至 1 mL 用来测电导。用电导测量仪直接读出稀释液的电导值，与同样稀释的透析液的电导值相比较。 13) 将提取物从透析袋中移出，最后一次检测其电导率以确定透析已经完成。将提取物25000 g 离心 20 min, 弃掉沉淀。 14) 测定上清中蛋白质浓度。根据需要分装，浸入液氮中速冻，-80℃保存。 |
| 注意事项 | 所有步骤的操作均在0〜4℃进行，在冷室内操作更好。缓冲液和设备要预冷。所有离心均在4℃进行，转子要预冷。 |
| 其他 |
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