从正常人和骨关节炎患者的关节软骨中分离软骨祖细胞

人关节软骨

胰蛋白酶 EDTA:胰蛋白酶（0.05%)和EDTA(0.53 mmol L)PBSA配制 胎牛血清 牛血清白蛋白（BSA) 10μg ml和1 mg ml PBSC配制 血清纤连蛋白 10μg  m1 PBSC配制

尼龙膜 40μm筛孔（“细胞滤网”） 离心管50ml  带圆锥底部便于细胞离心 解剖刀片 镊子 2对（1大1小） 矿油凝胶（凡士林） 克隆环 6 mm 微量离心机 分离软骨用的锁子甲手套 记号笔

A.组织收集和细胞分离

(a)无菌条件下，用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨（见本方案后的注解1)。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中。

(b)用镊子和刀片仔细将软骨切成1 mm³小块。

(C)将软骨小块转移至含18 mL链霉蛋白酶消化培养基的普通器皿或离心管中。

(d)置于滚转机37℃处理1 h。

(e)吸出消化液弃之。

(f)加人18 ml胶原酶消化培养基，再次置于滚转机37℃处理1 h。

(g)细胞滤网过滤,，

(h)用血细胞计数板进行细胞计数。

(i)加人黏附测定培养基，620g离心10 min进行洗涤，用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞（4000个细胞）。

B.差异黏附测定

(a)用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿，4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA。

(b)吸出液体，用含1 mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min。

(c)加人2 ml培养基重悬的细胞悬液静置20 min。

(d)吸出培养基和未贴壁细胞，置于第二个培养皿中20 min。

(e)向第一个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于鮮箱。

(f)从第二个培养皿中吸出培养基和未贴壁细胞至第三个培养皿中。

(g)向第二个培养皿中加人2 ml生长培养基后置于孵箱。

(h)向最后一个培养皿中加人200μl FBS后置于孵箱。

(i)3 h后，用相差显微镜计数最初贴壁的细胞。

(j)培养细胞，至明显可见多于32个细胞的集落（见注解2)，一般需10天。

(k)用以下公式计算集落形成率（GFE):

CFF=χ天的集落数/0天贴壁细胞的细胞数

集落扩增

(a)用相差显微镜鉴定多于32个细胞的细胞集落，在培养皿下用记号笔将其画圈标记（见注解4）

(b)计数和记录每个集落的细胞数

(C)从Petri培养皿中吸出培养基，用PBSA润洗。

(d)在克隆环上无菌涂抹凡士林，或者使用无菌镊子直接将其浸人凡士林

(e)将克隆环置于集落上（见注解5)，向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液5〜10 min—相差显微镜观察细胞已脱离。

(f)重悬细胞，置于Eppendorf管中，300g离心5min(见注解6)

(g)生长培养基洗涤，重复上述离心。

(h)生长培养基稀释，12孔板中每孔接种1个集落。

(i)细胞汇合时接种至3.5cm培养皿(或6孔板），然后再移至较大培养瓶25cm²，75cm²最后为175cm²。

注解:

⑴ 解剖小块软骨或单个髁状突时，解剖过程巾用大镊子抓牢将其固定，如果解剖整个骨髁，戴好领子甲手套（乙醇清洗）固定关节。软骨很滑，并且髁状突呈弯曲状，很容易割伤自己！表面滴加灭菌PBSA可保持软骨湿润。

⑵ 择大于32个细胞的集落，需注意避免选择可形成过渡放大群的细胞（祖细胞的直接后代），它们正常可扩增5个群体细胞倍数（PDs)。'

⑶可以通过实验观察和借助显微镜等一系列方法标记集落，例如，通过物鏡放大后进行标记。有些人直接将克隆环放在集落上，在层流通风橱中使用显微镜。标记圈应适合倒置显微镜的物镜转换盘，可从Nikon获得。

(4)如果需要精确判定细胞所经过的集落扩增倍数，计数每个集落中的细胞尤为重要。

(5)确保要标记的集落间有足够的空间以避免污染；或者可能的话将克隆环缩小

(6)如果使用较小的克隆（35〜50个细胞），Eppendorf洗涤的步驟可以省略，将带有胰蛋白酶/EDTA的细胞直接转移到12孔板中，所含的2 ml生长培养基足够中和

(7)软骨的细胞外基质均随年龄增多。所以，消化时间随着供者的年龄有所变化，年轻供者的组织较短的时间即可完全消化。应切记尽量缩短使细胞脱落的消化时间以保证最大的细胞存活率。在胶原酶中以小时间隔进行急剧搅拌可加速组织溶解过程。作为指导，每克软骨中至少加7 ml消化液，超过此体积无妨但浪费试剂。如果是年龄很小的供者，参考以下的胎儿软骨操作步骤。

(8)克隆细胞系转移至6孔板或3.5cm petri培养皿,生长良好时，几天内可汇合，按1:2稀释度传代。更大比例的稀释（1:4或1:8)可应用于更成熟的培养物。

(9)使用胶原酶时单位活性很重要，因为不同批次间可相差3倍。建议做批次试验。