从石蜡包埋固定的组织中制备RNA实验

石蜡包埋的组织样品

甲酰胺 消化缓冲液 乙醇 肝糖 异丙醇 苯酚 氯仿 蛋白酶 K Trizol 二甲苯

微量离心管 恒温箱

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去离子化的甲酰胺

焦碳酸二乙酯（DEPC) 处理过的水

消化缓冲液（lmol/L 异硫氰酸胍,25 mmol/Lβ-巯基乙醇，0.5%N-月桂酰肌氨酸，20 mmol/LTris-HCl，pH7.5)

乙醇,100% 和 70%

肝糖

异丙醇

苯酚 (pH4.3): 氯仿（70%:30%)

蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg)

Trizol(Invitrogen)

二甲苯

2. 特殊设备

微量离心管，2 ml, 无 RNA 酶

恒温箱，预调至 37°C

水浴或恒温箱，预调至 55°C

3. 细胞和组织

石蜡包埋的组织样品，切割为 5~50 张 5um 厚的切片

二、方法

1. 将组织块置于 2.0 ml 微量离心管中，向样品中加 1.8 ml 二甲苯。37°C 温育 20 min。

2. 稍微地离心样品，移弃上清液再加入二甲苯，重复温育和离心步骤。

3. 用 0.5 ml 乙酵洗涤组织。移弃乙醇，风干。

4. 加 80ul 蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg) 和 72ul 消化缓冲液。55°C 下振荡温育过夜。

5. 再次加 80ul 蛋白酶 K，55°C 下振荡温育过夜。次日再次加 80ul 蛋白酶 K, 再次 55°C下振荡温育过夜。

6. 加等体积酚：氯仿，混合，在微量离心机中以最大转速离心 5 min。将液相转移到RNA 酶的新管中。

7. 加等体积异丙醇和 2ug 肝糖，-20°C 放置 30 min。

8. 在微董离心机中以最大转速离心 30 min。移弃上清液，用 70% 乙酵洗涤沉降物。

9. 在微量离心机中以最大转速离心 30 min 并移弃上清液。风干沉降物，将之再溶解20ulDEPC 处理过的水中。加 500ulTrizol。遵循 Trizol 方案（见本章方案 3)，对一处做修改：在第一次 Trizol 处理后，将液相转移到无 RNA 酶的新管中，用 500ulTrizol 第二次处理样品。

10. 向第二次 Trizol 处理过的液相加 500ul 异丙醇以沉淀 RNA。

11. 将 RNA 沉降物再溶解于 20ul 去离子甲酰胺中。-20°C 储存 RNA。