使用荧光底物的直接ELISA实验方案

实验概要

使用荧光偶联一抗的直接 ELISA 测定的程序。

实验步骤

第 1 天：

1. 在滤过的 PBS 中稀释包被抗体后，在每孔中加入 100 μl 进行包被。用封板膜覆盖酶标板，将酶标板在 4℃下孵育过夜。

第 2 天：

2. 将 4 g Block ACE 粉末稀释于 100 ml 去离子水中，使用其 1:4 稀释液在每孔中加入 200 μl，在室温下封闭酶标板 3 小时，封闭期间用封板膜覆盖酶标板。

3. 洗涤酶标板：PBS-T (0.05% Tween20) 250 μl/孔；3x 30 s。

4. 取 100 μl 刚刚在 10% BlockACE 的 PBS-T 溶液中稀释的标准品或样品，上样到酶标板，并在 4℃下孵育过夜，孵育期间用封板膜覆盖酶标板。

第 3 天：

5. 以 100 μl/孔的量添加稀释于 PBS 中的生物素化报告抗体，在室温下孵育 2 小时，孵育期间用封板膜覆盖酶标板。

6. 以 100 μl/孔的量添加以 1:5000 稀释于 PBS 中的链霉亲和素碱性磷酸酶，在室温下孵育 1 小时，孵育期间用封板膜覆盖酶标板。

7. 洗涤酶标板：TBS 250 μl/孔；3x 30 s。

8. 以 100 μl/孔的量添加 AttoPhos 荧光底物系统，在室温下孵育 5-10 分钟，使信号放大。使用前应将 36 mg AttoPhos 底物与 60 ml AttoPhos 缓冲液混合 24 小时。确保孔干净无污染。

9. 在荧光计（Perkin Elmer 生产的 Victor2）上测定信号；激发波长：440 nm；发射波长：550 nm。