使用NTAIDA填料纯化蛋白的常见问题解析

Ni Tanrose 6FF（NTA）亲和介质是将金属离子Ni2+螯合在以氨三乙酸（NTA）为配基的琼脂糖凝胶上形成的亲和层析介质，较 IDA 结合Ni2+牢固一些。具有吸附量大、选择好、易于再生、成本低等特点，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质和多肽的分离纯化，尤其是组氨酸标签蛋白质的高效纯化。

Ni Tanrose 6FF（IDA）亲和介质是将金属离子Ni2+螯合在以亚氨基二乙酸（IDA）为配基的琼脂糖凝胶上形成的亲和层析介质，是一种非常悠久的Ni2+亲和填料，由于Ni2+与配基鳌合键较少，容易受到小分子的攻击而使Ni2+容易脱落，但其载量也相对较高。

以下是使用NTA/IDA填料可能会出现的问题及解决方法：

01 通过His标签纯化的蛋白，杂质比较多应当怎么做？

①可能原因：蛋白酶会降解部分目的蛋白。

解决方法：加入多种蛋白酶抑制剂改进。

②可能原因：杂质蛋白与镍柱亲和力强。

解决方法：可提高杂质蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度。

③可能原因：杂蛋白和目的蛋白结合。

解决方法：可通过超声前加入去垢剂或者还原剂消除（1%-2% Triton X-100）。

④可能原因：洗涤不充分。

解决方法：增加洗涤的次数，充分洗涤。

02 标签蛋白不与金属螯合亲和层析柱结合应当怎么做？

①可能原因：超声的功率不对（功率太大会导致蛋白炭化，功率太小会导致蛋白没有释放）。

解决方法：改变超声功率或超声前尝试添加溶菌酶增加细胞破碎率。

②可能原因：组氨酸标签暴露不完Q。

解决方法：在变性条件下（4-8M脲或4-6M盐酸胍）进行纯化，此时Ni-6FF（IDA）中镍离子容易脱落，可选择耐受变性剂的螯合填料，如月旭科技的亲和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）。

③可能原因：His标签丢失。

解决方法：WB检查His-tag是否表达，上游构建，改变His-tag的位置（C-端或N-端），必要时增加标签个数；孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。

03 用几次后镍柱载量下降、挂柱效率低，应该怎么做？

可能原因：

逐渐积累沉淀，变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，并且通过洗脱液无法彻底清洗所致。

解决方法：

较温和的清洗方式：用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤，然后用5倍体积的缓冲液洗涤，以去除沉淀或变性物质，接着用2倍柱体积的1% Triton X-100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤，以去除疏水结合的物质。若改变不明显，可选择强烈清洗方式。

强烈清洗方式：首先用5-10倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mM 磷酸钠，0.5 M NaCl,，50 mM EDTA，pH 7.4）洗涤，进行脱镍操作，然后用5-10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用5-10倍柱体积的双蒸水冲洗；随后进行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5M NaCl溶液，然后10倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用1M氢氧化钠溶液，结合1-2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍柱体积的双蒸水洗涤；最后进行生镍操作，用0.1M硫酸镍上柱，随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤。如需保存，保存在20%乙醇溶液。

04 签蛋白结合在填料上洗脱不下来，应该怎么做？

①可能原因：洗脱条件太温和（标签蛋白仍然结合在柱上，结合力较强）。

解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。

②可能原因：降低pH的方法洗脱，若pH低于3.5，会导致镍离子脱落。

解决方法：改变洗脱办法，如咪唑竞争性洗脱。

③可能原因：蛋白已沉淀在柱上。

解决方法：1.减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的浓度，或在变性条件（去折叠）下洗脱（用4-8 M脲，或4-6 M盐酸胍）；2.蛋白在柱上变性固化，用0.5M氢氧化钠洗柱。

④可能原因：非特异性疏水或其他相互作用。

解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的浓度。

⑤可能原因：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集。

解决方法：选择合适载量的填料，切勿一味追求高载量。

05 柱使用过程中发现堵塞严重，且流速越来越慢应该怎么做？

可能原因：

样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致。

解决方法：

样品处理过程中，高速离心，推荐用0.45um的滤膜过滤。如果柱子堵塞严重，重生时使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。流速慢，可在柱子下面接一根软管。

06 镍柱使用过程中出现棕色应该怎么做？

可能原因：

缓冲液中DTT的影响，DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响，在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以要尽量避免DTT的参与。

解决方法：

若样品中含有DTT，在上样之前, 我们推荐采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子。

空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）：

1）5倍柱体积的双蒸水洗柱；

2）5倍柱体积的平衡液洗柱；

3）5倍柱体积的洗脱液洗柱；

4）10倍柱体积的平衡液平衡。

当不使用时，勿将Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含还原性试剂的缓冲液中。