免疫球蛋白提取技术（一）

免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。

随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。

硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。

免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。

一、IgG的分离与提纯

1、材料与试剂配制

（1）动物血清

（2）硫酸铵饱和溶液

硫酸铵800g~850g

H2O 1000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28%NH₄OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

（3）0.01Mol/L pH7.4PBS液

A液：0.10Mol/L NaH₂PO₄液

NaH₂PO₄•；2H₂O 15.60g

加H₂O至1000.ml

B液：0.10Mol/L Na₂HPO₄液

Na₂HPO₄•；12H₂O 35.80g

加H₂O至1 000ml

取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。

（4）1%BaCl₂溶液

（5）纳氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加H2O至500.00ml

溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。

（6）0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。

（7）洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。

（8）透析袋（或玻璃纸）。

2、操作方法

（1）取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4）₂SO₄饱和溶液10ml，使成20%（NH4）₂SO₄溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

（2）3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

（3）在上清液中再加（NH4）₂SO₄饱和溶液30ml，使成50%（NH4）₂SO₄溶液，充分混合，静置30min。

（4）3000r/min离心20min，弃上清。

（5）于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）₂SO₄饱和溶液10ml，使成33%（NH4）₂SO₄溶液，充分混合后，静置30min。

（6）3000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。

（7）10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

（8）除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

以1%BaCl₂检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 （取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH₄ 存在），直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

（9）离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。

（10）过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。
也可采用SephadexG150或G200柱。

（11）蛋白质及其定量鉴定。