免疫球蛋白提取技术（二）

4、禽血清IgG的分离与提纯（Na₂SO₄法）

（1）试剂

①5%葡聚糖硫酸盐

②0.02Mol/L MnCl₂溶液

③无水硫酸钠

④pH8.2硼酸盐缓冲液

⑤0.06Mol/L pH7.4PB液

（2）操作方法

①取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl₂1.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。

②于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。

③以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。

④重复步骤③，加Na₂SO₄，使成0.14g/ml。

⑤以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。

⑥过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。

⑦如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。

也可以按以下操作方法进行：

①以18%硫酸钠（W/V）提取一次，再以14%的硫酸钠提取一次。

②将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9%加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO₄^2-为止。

③离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。

④过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。

二、IgM的分离与提纯

1、材料

（1）血清

（2）葡聚糖凝胶G200

（3）洗脱液0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris－HCl 0.14Mol/L NaCl）

2、操作方法

选取2.50cm×90cm层析柱，用葡聚糖凝胶G200装柱，平衡后，直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品，洗脱液洗脱，流速0.25ml/min，分管收集，测OD280值，第一峰即为IgM。将第一峰的数管混合，浓缩、鉴定。

三、IgA的分离与提纯

1、材料与试剂配制

（1）DEAE52纤维素

（2）0.10Mol/L ZnSO₄液

ZnSO₄•；7H₂O 2.88g

加水至1000.00ml

（3）饱和硫酸铵溶液

（4）10%EDTA—Na

（5）SephadexG200

（6）0.01Mol/L pH7.4PB液

（7）0.10Mol/L pH6.4PB液

（8）血清

2、操作方法

（1）取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO₄液，调pH至7.0，室温搅拌1h，离心去沉淀。

（2）于上清液中加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置30min或冰箱过夜。

（3）10000r/min离心10min，去上清。

（4）取沉淀溶于4ml10%EDTA－Na溶液中。

（5）生理盐水中透析除盐。

（6）过DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱蛋白（IgG）弃去。

（7）换用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脱，收集蛋白峰，即为IgA。

（8）再过SephadexG200柱，洗液为0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脱液测OD280值，取第一峰即为纯化IgA。

（9）透析、浓缩、鉴定。

四、分泌型IgA的分离与鉴定

1、材料与试剂

（1）初乳

（2）SephadexG200

（3）0.10Mol/L pH6.8PB液

（4）0.01Mol/L pH7.4PB液

（5）DEAE52

2、操作方法

（1）取初乳20ml，10 000rpm离心10min，弃去表面脂肪层及底部的沉淀物。

（2）取乳清过SephadexG200柱（柱规格为2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脱，第一峰为IgA（含IgG）。

（3）收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。

（4）将透析液浓缩至5mg/ml以上。

（5）过DE52层析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脱，洗下蛋白峰为IgG，弃去。

（6）换用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脱，

收集洗脱液，即为较纯的IgA液。

（7）必要时，可再过一次SephadexG200柱。

（8）浓缩，鉴定

五、禽IgA提取与纯化

1、材料与试剂配制

（1）禽胆汁

（2）饱和硫酸铵溶液

（3）0.01Mol/L pH7.4PBS液

（4）0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）

（5）DEAE52-纤维素

2、操作方法

（1）取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25%饱和硫酸铵液。4℃放置30min。

（2）3000r/min离心30min，去沉淀。

（3）取上清，加饱和硫酸铵液，使成35%的饱和度，4℃放置30min。

（4）3000r/min离心30min，弃上清。

（5）取沉淀，加0.85%NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。

（6）将沉淀用0.85%NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。

（7）以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱（20×250mm）。

（8）取透析样品4ml（﹥20mg/ml蛋白浓度）加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。

（9）再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl浓度为0.30Mol/L）洗脱，收集洗脱液。

（10）浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。

六、IgE的分离与提纯

1、材料与试剂

（1）血清

（2）饱和硫酸铵溶液

（3）洗脱液0.005Mol/L pH7.4PB液

0.025 Mol/L pH7.4PB液

0.01Mol/L pH7.4PBS液（0.14mol/L NaCl）

（4）DE52

（5）SephadexG150

2、操作方法

（1）取血清倍比稀释后，加等量饱和（NH4）2SO4溶液，盐析。

（2）离心取沉淀，溶于少量生理盐水中，透析、除盐。

（3）过DE52柱，以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脱，收集洗脱蛋白峰（IgG），弃去。

（4）换以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗下的蛋白峰主要是IgE。

（5）透析除盐。

（6）过G150柱，以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液即为纯化的IgE。

（7）浓缩、鉴定。