免疫球蛋白提取技术（二）

（12）IgG的纯度鉴定，可采用下列方法之一鉴定。

①玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可

加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）₂SO₄盐析样品进行电泳，以资比较。

②琼脂双相双扩散鉴定

预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

③免疫电泳鉴定

孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

④圆盘电泳鉴定

用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。

（13）IgG的浓缩与保存

①IgG的浓缩

②IgG的保存

一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

3、IgG的简易快速提取法

应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。

（1）DEAE-纤维素直接提取法

取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。

①以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PBS缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。

②用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。

③以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。

④于4℃中放置1h，中间搅拌数次。

⑤用布氏漏斗抽滤，再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。

（2）DEAE－SephadexA－50为弱碱性阴离子交换剂，经NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ－G。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得γ－G无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。

①DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE－SephadexA－50若干克，悬浮于蒸馏水中，1h后倾去上层小颗粒，然后用0.50Mol/L NaOH处理1h，蒸馏水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。

②取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液体体积1/4的滤干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不时搅拌、抽滤、收集滤液。

③再用同样重量的DEAE－SephadexA－50处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为γ－G制品。

④DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。

4、禽血清IgG的分离与提纯（Na₂SO₄法）

（1）试剂

①5%葡聚糖硫酸盐

②0.02Mol/L MnCl₂溶液

③无水硫酸钠

④pH8.2硼酸盐缓冲液

⑤0.06Mol/L pH7.4PB液

（2）操作方法

①取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl₂1.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。

②于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。

③以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。

④重复步骤③，加Na₂SO₄，使成0.14g/ml。

⑤以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。

⑥过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。

⑦如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。

也可以按以下操作方法进行：

①以18%硫酸钠（W/V）提取一次，再以14%的硫酸钠提取一次。

②将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9%加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO₄ ^2-为止。

③离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。

④过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。