免疫球蛋白纯化技术

血清

生理盐水 硫酸铵溶液 萘氏试剂 磷酸盐缓冲盐液 磺基水杨酸

冰箱 离心机 搅拌器 紫外分光光度计 扭力天平 粗天平 透析袋 尼龙绳 竹棒、PH试纸 镊子 剪刀 烧杯 量筒 吸管 滴管 灭菌小瓶 试管

1.  取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50 ％饱和（NH_4）2SO₄]，4 ℃，3 小时以上，使其充分沉淀

2.  离心（3000 rpm）， 20 分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至X ml。再逐滴加饱和硫酸铵X/2 ml，置4 ℃，3 小时以上［此时（NH_4）2SO₄的饱和度为33 ％)］

3.  重复上述第二步过程多次。将末次离心后所得沉淀物以0.02 M PH7.4 PBS溶解至X ml装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色

4.  将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。

方法如下

蛋白含量（mg/ml）＝（1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm）×样品稀释度。

注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。

一、影响盐析的因素

1.  蛋白质的浓度

盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
 

2.  离子强度

各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50 ％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33 ％时γ球蛋白析出。
 

3.  盐的性质

最有效的盐是多电荷阴离子。
 

4.  PH值

一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。

5.  温度

盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25 ℃时较0 ℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
 

6.  蛋白质沉淀后宜在4 ℃放3 小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。