实验概要
免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
实验步骤
1. 将脑片放到,6 孔板(或 12 孔板),按照二抗说明书,加 3%双氧水封闭 10min(如果是从切片保护液取出,则要用 PBS 洗一遍);(二抗不同,操作步骤有差别);
2. 吸去双氧水,PBS 洗两遍,将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净,注意不要碰到脑片;
3. 然后按照一抗说明书,将一抗按比例稀释,加入稀释后的一抗,一般,大鼠脑片一张需 50 微升一抗稀释液,小鼠脑片为 30 微升;注意不要让液体流到边上;如果流到边上,要重新加或者加大量,使脑片完全浸入液体;
4. 然后,4℃,过夜(18h 或者 24h),不建议使用 37℃;
5. 然后,PBS 洗净两遍;剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6. DAB 配方为:10mg DAB 固体加到 20ml 0.01MPBS,临用时加 100-200 微升30%双氧水,注意避光。
7. 显色 10min,看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般 3 分钟显色就比较明显,如果 20 分钟仍未显色,则看下面的参考。
8. 然后 PBS 洗两遍,转移到载玻片,自然晾干。干燥天气 2-3h,潮湿天气 3-4h。
9. 脱水:70%酒精 3min,95%酒精 3min,100%酒精 3min,100%酒精 2min,二甲苯 2min,二甲苯 3-5min。如果片子上盐分较多,在 70%酒精前在双蒸水1min。
10. 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中,封闭 20-40min;(如果是从切片保护液取出,则要用 PBS 洗一遍)
11. 吸去山羊血清,PBS 洗两遍,将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净,注意不要碰到脑片;
12. 然后按照一抗说明书,将一抗按比例稀释,加入 PBS 稀释后的一抗,一般,大鼠脑片一张需 50 微升一抗稀释液,小鼠脑片为 30 微升;注意不要让液体流到边上;如果流到边上,要重新加或者加大量,使脑片完全浸入液体;
13. 4℃,过夜(18h 或者 24h),不建议使用 37℃,如果荧光亮度不强,可以延长孵育时间到 48 或 72 小时;
14. 然后,PBS 洗净两——三遍,按照二抗说明书稀释的荧光二抗,室温孵育 2小时。注意避光操作。
15. 0.01M PBS 洗两遍,转移到载玻片上,避光自然晾干;
16. 滴加防淬灭剂后,盖上盖玻片镜下观察。
注意事项
1. 荧光太暗:可能蛋白表达少;可能一抗孵育时间短;二抗孵育时间短;清洗次数过多;溶液 pH 不合适;荧光萃灭;一抗浓度过低或过高;二抗浓度过低或过高;激发波长不在抗体适用波段。
2. 背景荧光太深:一抗浓度过高,清洗不彻底;二抗浓度过高,清洗不彻底;封闭时间过短,非特异性过强;一抗非特异性过强;二抗非特异性过强;显微镜荧光强度过强。
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