关于菌落总数测定方法的影响因素

　　一、菌落总数的概念及卫生意义

　　1、菌落总数

　　食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL （或1g）检样中形成菌落的总数。

　　按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在 平板计数 琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

　　2、细菌总数

　　细菌总数指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL或1cm2样品中的细菌总数来表示。

　　3 菌落总数在食品卫生质量评价中的意义

　　1）食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度

　　新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的，但由于外界污染情况不同，食品被细菌污染的多少就有所不同。食品中细菌数量越多，说明被污染的程度就越严重，越不新鲜，对人体健康威胁越大。相反，食品中菌数越少，说明该食品被污染的程度越轻，食品卫生质量越好，对人体健康影响也越小。

　　2）食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间

　　一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相反，食品耐放时间就越短，例如用O℃保存牛肉，菌落总数为103cfu／cm2时，可保存18天，而当菌落总数增至lO5cfu／cm2时则只能保存7天。另外，用0℃保存鱼时，菌落总数为105cfu／cm2时可保存6天．而菌落总数在103cfu／cm2时则可保存12天。

　　3）食品中细菌数量可估测出食品腐败状况

　　一般认为日常食品的活菌数为104～107cfu／g。而当活菌数达到108cfu／g则可认为处于初期腐败阶段。例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数可低到1.5×103cfu／cm2。而加工后马上检测可达3.5×104cfu／cm2。当菌落数为107cfu/cm2时表示确已经腐败，鸡肉的细菌数达108cfu／cm2时可有气味并变粘。

　　一般讲，食品中细菌数量越多，则会加速腐败变质过程的进程，甚至可能引起食用者的不良反应。

　　二、菌落总数检测方法

　　菌落总数的常规检验方法菌落总数的常规检验方法(GB4789．2-2008)：

　　基本操作一般包括：样品的稀释——倾注平皿——培养48（24）小时——计数报告。

　　（一）样品的处理和稀释：

　　1．操作方法：

　　1）、以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。

　　固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。

　　2）、用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。

　　3）、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。

　　2．无菌操作：

　　操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。

　　操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

　　3．采样的代表性：

　　如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

　　4．稀释液：

　　样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。

　　（二）倾注培养

　　1．操作方法：

　　1）、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

　　2）将凉至46℃平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

　　3）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

　　4）倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。

　　倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察

　　5）为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。

　　6）温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。

　　7）为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培养基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。

　　在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。

　　（三）计数和报告

　　1. 操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。

　　2. 计数：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

　　3. 稀释度选择及菌落数报告方式

　　1）. 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。

　　2）. 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l）计算：

　　N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1）

　　式中：

　　N―样品中菌落数；

　　∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

　　n 1―第一个适宜稀释度接种平板个数

　　n2―第二个适宜稀释度接种平板个数；

　　d―稀释因子（第一稀释度）。

　　3）. 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

　　4）. 若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

　　5）. 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

　　6）. 若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

　　4. 菌落总数的报告

　　1）. 菌落数在100以内时，按“四舍五人”原则修约，采用两位有效数字报告。

　　2）. 大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

　　3）. 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

　　4）. 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

　　5）. 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。

　　（四）特别注意

　　1 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。

　　2．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

　　3．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。