冠状病毒及其离心分离

一、冠状病毒概述：

冠状病毒是引起感冒的主要病原，它只感染脊椎动物，可引起人与动物的呼吸道、消化道与神经系统病患。冠状病毒的代表株早已被科学家查明，典型的如B814(1965,Tyrrell),229E(1996, Hamre),OC 43(1967,Melntosh)等等，此后，Almeida对冠状病毒时完整形态进行了研究发现在它的脂质膜的外表面分布着类似日冕形状的纤突，故命名为冠状病毒。我国在1975年正式命名。目前流行的非典肺炎的病源，根据已完成的病毒基因图谱排列（E.S.M.N蛋白，多聚酶及3CL蛋白水解酶和核苷酸序列）表明它是新发现的变异冠状病毒，可能是动物传给人类的。冠状病毒和其他危害人类的病毒一样，只有当它同细胞（或细菌）结合时才能获得一些生命系统的特征。通常它是以微小的传染颗粒的形式（病毒粒子）在细胞内传播。他的化学组成主要是核酸和蛋白质。几何尺寸为100~200nm，沉降系数700S~800S，在蔗糖液中的浮密度约为1.15~1.19。可以用电子显微镜来观察它的颗粒的完整形状和尺寸，进一步还可以观察到他的内部结构。

冠状病毒外形通常为近似球形。核酸位于中心部。最外部为纤突，是血凝素和神经胺酸酶的蛋白大分子，他附着在具有保护作用的脂质膜上。纤突是在病毒侵害人体细胞时附着到细胞上的吸附器。同时也是中和抗体的抗原。脂质膜往内依次是膜蛋白层。螺旋壳膜子粒、核酸链。

冠状病毒的核酸为双股线型RNA，同种冠状病毒的核酸序列是恒定的，但是病毒发生变异后其核酸与蛋白的序列也会发生某些微小的变化。

冠状病毒的生命周期中可见二个阶段交替存在：即细胞外阶级和细胞内阶级。细胞外阶级是以病毒粒子的状态存在，即线型核酸外包着蛋白质壳膜；细胞内阶级是以RNA形式存在，即当病毒核酸进入人体寄主细胞后，将引起病毒核酸的复制和特异病毒蛋白的合成。特异病毒蛋白包括组成病毒的壳膜和子粒的合成。由于冠状病毒的核酸是RNA，所以它既可以直接作为m RNA也可以转录形成一个互补的RNA股。冠状病毒进入人体寄主细胞后其信息通过人体细胞生物合成机构提供产能系统、核蛋白体、氨基酸活化酶、t RNA和其他组分来指导合成一系列的冠状病毒蛋白，其中重要的有病毒核酸复制所需要的酶及病毒壳膜内的子粒。再进一步，冠状病毒核酸自身作为复制的模板在特异聚合酶的作用下复制，并用上述由病毒核酸指导合成的病毒蛋白集装成壳膜包围成一个新的冠状病毒颗粒，从而进一步破坏人体的组织。

二、病毒的分离纯化：

i.取感染组织制成匀浆，普通低温离心机3000rpm x 20分，弃去沉淀。

ii.取上清液少许滴在装有火棉膠膜的铜网上，滤纸吸干后吹干，浸在2%醋酸铀中染色，然后在透射电镜中初步观测，确认是否有病毒存在，如有，上清液作进一步离心分离。

iii.清液作等密度离心分离，日立P40ST或其它品牌类似甩平转头，6 x 13ml，用薄壁PA管，12ml  10~50%蔗糖（分析纯）连续线性梯度，蔗糖梯度液表面铺上清液至距离心管口3mm，33000rpm  1小时，5℃。病毒应沉降在36%蔗糖梯度附近。离心完毕后取出离心管静置于试管架内，用上取法[日立DGF-U 密度梯度制备及片断收集仪（本身带管道泵）]，梯度仪泵出口连接到带流动池的分光光度计，连续测定离心管中从上至下各层次的吸光度（波长280nm~340nm需试验，优化）用记录仪或打印机绘出分层容量——吸光度曲线，病毒的峰显而易见。经过分光光度计的流动池后，每个离心管分部收集成50~100管，根据吸光度曲线中病毒峰位置可知病毒分布在哪（几）个离心管中，透析去蔗糖，可得到纯病毒样品。

iv.参照“生物大分子加密度梯度离心”用等密度离心法或速率一区带密度梯度离心法分离纯化病毒的蛋白和RNA并可作进一步测序研究。