减少测序错误，你做对了么？

　　不论是哪种测序平台，在测序过程中都不可避免地存在一些错误。Illumina的低成本高通量测序技术已经在许多领域得到了广泛应用，不过人们还不了解其系统性错误对测序数据的影响。

　　英国格拉斯哥大学的研究人员在16S rRNA扩增子测序的基础上，全面分析了Illumina台式测序仪的错误模式。他们由此找到了消除错误的有效策略，将这一测序平台的主要错误减少了93%。这项研究发表在前不久的Nucleic Acids Research杂志上。

　　“Illumina测序与454测序的方法完全不同，我们已经知道454测序时错误是如何产生的，但对Illumina的系统性错误还并不了解，”领导这项研究的Melanie Schirmer说。“鉴定小变异（比如病毒株或者菌株之间的突变）需要从背景中找出真正的遗传学变化。我们希望能够更好的理解测序时产生的系统性错误和偏差，尽量将其去除以便获得更加真实的信息。”

　　Schirmer及其同事用两台Illumina MiSeq进行了一系列测序，并将测序数据与参考基因组序列进行比对。他们通过自己开发的新算法，分析不同类型的错误出现在哪里，涉及了哪些核苷酸。

　　这项研究测试了五种文库制备方法、不同DNA量、不同PCR循环数、两种Taq聚合酶和不同的引物组合。“我们发现，测序读取上的错误聚集在特定位置，这些错误不完全取决于DNA片段的序列，而是与实验设计等因素有关，比如文库制备方法和正反向引物，”Schirmer解释道。

　　研究显示，核苷酸替换类错误主要集中在测序读取的前10 bp，在测序读取的末端这类错误也会增多。有趣的是，测序错误在测序读取上的特定位置还会出峰值。研究人员经过分析后指出，文库制备方法加上引物的选择，会使特定区域出现核苷酸替换、插入和删除错误。

　　既然测序错误不是随机出现的，那么就可以想办法将其去除。Schirmer等人经过比较找到了最有效的错误消除方法：把现有校正技术结合起来使用（Sickle、BayesHammer和PANDAseq），可以使主要的测序错误减少93%。