分子标记—AFLP原理和操作步骤

DNA样品

Taq酶 EcoRI  MseIEcoRI  MseI接头 E+A引物M+C引物 T4DNALigaseE和M引物 琼脂 过硫酸胺 丙烯酰胺 尿素 硝酸银 甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸 玻璃硅烷 50bpMark

电泳仪 离心机 Eppendorf管 凝胶成像仪 紫外分光光度计 37℃水浴锅 PCR仪

一、基因组DNA提取和纯化

1. 大量提取DNA（实验方法视DNA来源而异，此处略）。

2. DNA的纯化：

（1）用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化。

（2）首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次。

（3）离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，——20℃放置2h以上。

（4）10000xg离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，风干后溶于30μl TE缓冲液中。

（5）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。

二、限制性酶切及连接

1. 在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸水补至25μl。

2. 用PCR扩增仪设定37℃过夜反应后，于65℃，20min灭酶活，——20℃保存，作为预扩增模板。

三、预扩增

1. 取3μl酶切连接产物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。

反应参数为：94℃ 90s；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，30循环；72℃ 10min。

2. 反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测扩增产物，取3μl产物释稀50倍，用作选择性扩增模板。

四、选择性PCR扩增

1. 取释稀后的产物3μl，加入EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。

反应参数为：94℃ 90s；94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 1min，13循环（每循环降0.7℃）；94℃ 30s， 56℃ 1min，72℃ 1min，25循环；72℃ 5min.

2. 反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。

五、凝胶电泳

1. 扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度0.5mm）和1×TBE电泳缓冲液电泳分离）。拔出梳子，140W恒功率预电泳30分钟，温度达到47——49℃。务必使每个孔清洗出尿素。

2. 选择性扩增产物中加入等体积上样缓冲液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性5 min，结束后迅速置于冰上直到点样。

3. 每个泳道加样8μl。一开始用100W恒功率电泳约2分钟，使样品迅速集中到孔底部，再调到60W恒功率电泳，温度保持在43℃左右，待二甲苯青泳动至玻璃板2/3处，结束电泳。

六、银染

1. 固定液配制：取100ml冰醋酸到900ml去离子水或双蒸水中。

染色液：1g AgNO₃，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至1L。

显色液：30g Na₂CO₃，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸钠，加去离子水至1L。

2. 具体操作流程

（1）电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。

（2）固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡30min。固定结束后，固定液保留。

（3）加入去离子水漂洗3次，每次2min。

（4）染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡30min。用去离子水漂洗凝胶10秒钟后，置入显色盘中。

（5）显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。

（6）终止：加入（2）步骤用后的固定液，来回漂几分钟。达到最好效果后，用蒸馏水漂洗几分钟。

（7）去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用数码相机拍照。

七、数据分析

用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。