利用双向层析法对氨基酸进行分离与鉴定

实验概要

本实验介绍了氨基酸分离与鉴定——双向层析法（two-dimensional chromatography）的原理及操作步骤等。

实验原理

纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。

Rf=原点至纸层析斑点中心点的距离/原点至溶剂前沿的距离

纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。

由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。

纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。

层析溶剂要求：

1. 被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。

2. 溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。

3. 被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。

本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。

主要试剂

1. 0.1%（W/V）茚三酮丙酮液。

2. 溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；

第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。

主要设备

1. 层析缸25×1000px（×2）；

2. 培养皿375px（×2）；

3. 喷雾器；

4. 毛细管内径2.5px；

5. 电吹风；

6. 烘箱；

7. 层析滤纸 12×300px，铅笔，尺等。

实验材料

标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于 50mL 0.01M盐酸中。

实验步骤

1. 点样

取层析滤纸一张（12×300px），在距纸边30px处划一基线；再将纸转90°，距纸边30px处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处，点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。

2. 展层

在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边12.5px处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上，图），约1小时后溶剂展开到距纸边12.5px时取出，用电吹风吹尽溶剂使其干燥。

纸层析点样、展层示意图

（X, Y分别为原点至斑点中心和溶剂前沿的距离，x为点样原点）

3. 显色

用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内，烘30分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。

注意事项

1. 烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。

2. 第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化，影响层析效果。

3. 整个实验操作应戴手套进行。

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