动物细胞／组织培养常见的一些问题

由于影响因素过多，细胞/组织培养中出现的一些问题往往很难分析并得到解决，因此被人戏称为“黑色艺术”或“巫术”。本文列举了一些动物细胞/组织培养中常见的问题及解决方法。
 
1.培养试剂的保存：
血清：-5oC - -20oC 保存，避免反复冻融。
培养基:  2oC – 8oC避光保存。
完全培养基: 2oC – 8oC避光保存，并在2周内用完。
尽量缩短血清和培养基见光的时间 
 
2.液体培养基中谷氨酰胺使用方法：
很多细胞生长要求在培养液中添加谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20◦C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4◦C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。另一种选择是使用L-谷氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex配方中含有的成分之一） 替代L-谷氨酰胺。Glutaplex与L-谷氨酰胺相比更加稳定，降解比较慢，提高细胞的存活和生长，极大降低对细胞有毒性的氨的积累。
 
3.培养基中是否应加酚红：
酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂，中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，特别是雌激素。为避免固醇类反应，培养细胞尤其是哺乳类细胞时，应使用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时不使用加酚红的培养基。

4.使用血清应注意的问题：
1）血清第一次使用前，是否应在56oC，30分钟加热血清以灭活补体系统？
激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞生长只有微小的促进或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率降低。而经过热处理的血清沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染。而把血清放在37℃环境中又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量。
 
2）通常使用的血清的种类：
新生牛血清：新出生牛5天内取血制成。小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为：（1）特级胎牛血清：40纳米过滤，内毒素含量≤10EU，   血红蛋白含量≤10mg/dl。（2）优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤25mg/ml。（3）标准胎牛血清：3次100纳米过滤，低内毒素，低血红蛋白含量。
 
3）为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?  
有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。建议在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。
 
4）血清解冻后发现有絮状沉淀物出现： 
血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成。而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后也会存在于血清中，也是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。
 
5）如何避免沉淀物的产生?  
我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作: (1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2℃至4℃过夜，37oC水浴解冻)。若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时要随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)如果在高于40oC的水浴中融化并且不时常摇晃混匀，非常容易造成沉淀物增多。同样血清的热灭活也造成沉淀增多，若非必要，可以省去热灭活。(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。 
 
5.培养用液pH对细胞生长的影响：
由于，大多数细胞培养适宜的pH为7.2-7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受力差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。
 
6.培养基pH变化迅速：
培养箱中CO2浓度不正确。碳酸氢钠在培养液中浓度范围为2.0 – 3.7g/L时，CO2的浓度范围应分别为5% - 10%。
 
7.使用培养基时应注意的问题：  
培养基在使用前需37oC预热。 细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间，减少污染机会。避免液体间、细胞间的交叉污染。配制完全培养基时，配制的量最好在2周内用完为好。
 
 
8.细胞传代消化时胰蛋白酶的使用问题：
培养细胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg+离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 oC 其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。每次进行传代消化前，一定要用无钙镁离子的PBS液或D-Hanks液反复冲洗细胞培养瓶，以便将含血清的培养基冲洗干净，这样可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为：   （1）０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ；   （2）０.２５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ。多数细胞传代消化可使用０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ这种消化液。

第一次开瓶后应立即少量分装于无菌管中，保存于–20℃，避免反复冻融造成胰蛋白酶活性降低，并可减少污染的机会。

注意：如果选用无血清培养基（如启维益成公司代理的TNC Bio公司生产的产品 - 完全无动物成分的血清替代品XerumFreeTM与其他培养基混合配制的无血清培养基），在细胞传代时，不可使用胰蛋白酶消化，因为胰蛋白酶在无血清时可去除细胞膜表面的受体，这种情况应使用AccutaseTM消化。
 
9.贴壁细胞在用蛋白酶消化时不易分离：
1）培养液中存在酶的抑制剂，可使用无钙镁离子的37oC预热的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍，再消化 
2）胰酶浓度太低，使用更高浓度的胰酶，更高浓度的EDTA或不同的酶消化，37oC消化以提高酶活性
3）细胞处于铺满状态时间太长，形成细胞间的紧密连接，以后注意在细胞铺满之前进行继代培养。
 
10.细胞分离后形成团块：
1) 细胞分散过程太过分，如用力吹吸、酶浓度过高、消化时间过长或温度过高，酶溶液有毒性（如缓冲液pH或渗透压不正确等）以至基因组DNA从破裂的细胞中释放出来。解决方法是在细胞悬液中加入1滴无菌的1mg/ml溶于水中的DNA酶。
2)去除上清时，细胞离心的强度太大或时间太长，应使用125g, 10分钟轻微离心。
 
11.悬浮细胞形成团块：
1）培养液中含有钙镁离子
2）支原体污染 
3）由于过度消化造成细胞裂解，释放出基因组DNA
 
12.细胞不贴壁：
1）消化时间过长，细胞膜上的贴壁蛋白被去除了
2）培养基中的血清或贴壁因子（常见于无血清培养基）不足，可在培养基中加入贴壁因子或使用胶原蛋白、多聚L赖氨酸、纤连蛋白等包被的培养瓶。
3）支原体污染
 
13.离心动物细胞的离心速率：  
回收动物细胞，离心速率一般为300g，5 - 10 分钟，离心强度过大将造成细胞破裂死亡。
 
14.细胞生长缓慢：
1）换用了不同的培养基或血清，解决方法是可比较不同培养基成分，用生长实验比较以前批次和新批次的血清， 提高接种细胞数，使细胞逐步适应新的培养基 。
2）L-谷氨酸等促进细胞生长的成分没加入，用尽或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如启维益成公司代理的GenDepot的产品Glutaplex）替代L-谷氨酸 
3）支原体污染或低水平细菌或真菌污染
4）培养试剂保存不当
5）接种细胞数太少
6）细胞传代次数太多
7）细胞传代时密度太高，应在细胞铺满前的指数生长期传代
 
15.细胞死亡：
1）培养箱中无CO2，检查管子有无泄漏，是否需更换CO2罐，尽量减少开关培养箱的次数 
2）培养箱温度不恒定
3）抗真菌剂或抗生素浓度过高，对细胞产生毒性
4）细胞在冻存或解冻过程中被破坏
5）培养基中渗透压不正确
6）培养基中积累了有毒的代谢产物
 
16.细胞冷冻培养基的成份：
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，所以不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
 
17.DMSO的等级及使用和保存：
   冷冻保存使用之DMSO 等级必须为Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C。避免反复冻融造成DMSO 裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。
 
18.冻存液中的甘油的保存：
要避光保存，见光后甘油转化为对细胞有毒性的丙烯醛。
 
19.细胞欲冷冻保存时注意事项：
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml为宜。实际操作时，建议按照细胞生产商建议的细胞密度冻存。冻存传代次数低的细胞。
 
20.冷冻保存细胞之方法：   
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30-60 分钟→ （-20℃ 30 分钟）→ -80℃16-18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存，如细胞浸在液氮中，有可能被液氮中的微生物污染。   
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡。也可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，但存活率降低。
 
21.细胞解冻：
快速解冻，将37oC预热的培养基逐滴加入解冻的细胞。
 
22.支原体污染、检测及处理：  
支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。
目前，支原体检测的方法有以下几种。（a）相差显微镜观察；（b）低张处理地衣红染色法；  （c）荧光染色法；（d）酶标法；  （e）PCR法：这是常用的一种简便的检测方法。  此方法灵敏度高，检测耗时短，样品量小（只需50ul细胞培养用液上清），但引物及制剂费用较高。
支原体污染的处理：1）丢弃细胞，培养基及其他培养用试剂 2）重新获取未污染细胞，新鲜培养基和试剂。