一、目的:
了解分离提取DNA的一般原理,掌握从动物肝脏中提取DNA的方法。
二、原理:
在浓氯化钠(1—2mol·L-1)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠(0.14mol·L-1 )溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的核蛋白用SDS(十二烷基磺酸钠)处理,DNA(或RNA)即与蛋白质分开,可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇,DNA即析出。
为了防止DNA(或RNA)酶解,提取时加EDTA(ethy-lenediamine tetracetic acid,乙二胺四乙酸)。
三、器材及试剂:
1.器材:
①新鲜猪肝(一次用不完一定要冷冻保存)
②匀浆器
③离心机5000r·min-1
④量筒50ml(×1)、10ml(×1)
⑤水浴锅
⑥纱布
⑦真空干燥器
2.试剂:
①5mol·L-1 NaCl溶液:将292.3gNaCl溶于水,稀释至1000ml。
②0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA-Na溶液:溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于蒸馏水,稀释至1000ml。
四、操作步骤:
1.取猪肝20~30g,用适量0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗去血液,剪碎,加入约30~50ml0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液,置匀浆器或研钵中研磨,研磨一定要充分,待研成糊状后,用单层纱布滤去残渣,将滤液离心10分钟(4000r·min-1)弃去上清液,沉淀用0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
2.向上述沉淀物加入0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液,使总体积为37ml,然后滴加25%SDS溶液3ml,边加边搅拌。加毕,置60℃水浴保温10分钟(不停搅拌)溶液变得粘稠并略透明,取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。
3.加入5mol·L-1 NaCl溶液10ml,使NaCl最终浓度达到1mol·L-1 ,搅拌10分钟,加入约一倍体积的氯仿-异戊(丙)醇混合液,振摇10分钟,静置分层,取上、中两层液离心10分钟(4000r·min-1)。去掉沉淀,上层清液徐徐加入1.5—2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻璃棒顺着一个方向慢慢搅动,则DNA丝状物即缠在玻棒上。
4.将DNA粗品置于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1柠檬酸三钠溶液中,再加入3ml1.5mol·L-1 NaCl-0.15mol·L-1 柠檬酸三钠溶液,搅匀,加入一倍体积氯仿—异戊(丙)醇混合液,振摇10分钟,离心(4000r·min-1 ,10分钟),倾出上层液(沉淀弃去),加入1.5倍体积95%乙醇,DNA即沉淀析出。离心,弃去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步骤重复一次。
5.将上步所得沉淀溶于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1 柠檬酸三钠溶液中,然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇,边加边搅,取出丝状DNA,依次用70%、80%、95%及无水乙醇各洗一次,真空干燥。保存待用。
五、结果与讨论:
1.所提取的DNA是否是纯品?如何进一步提高其纯度?
2.DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?
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