华人先锋《NatureMethods》利用CRISPRi绘制遗传互作图谱

　　斯坦福大学亓磊（Lei Stanley Qi）教授早年毕业于清华大学，现任斯坦福大学生物工程学、化学和系统生物学系的助理教授，近年来他在CRISPR研究领域取得了一系列突破性进展，比如第一次采用CRISPR-Cas9系统的变种技术，改变了读取诱导多能干细胞(iPSCs)基因组的方式（由此入选了生物通的2016年生命科学风云人物）。

　　作为基因组靶向改造（敲除和敲入）的遗传学手段，基因组编辑技术历经ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9，已发展成为自20世纪70年代生物技术时代开启以来最重要的基因工程技术。因没有物种限制、简单、高效，以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、猪、羊、水稻、小麦和拟南芥等动植物（细胞）以及细菌等微生物的基因组靶向改造，成为后基因组时代的功能基因组研究、动植物品种改良、疾病模型建立以及基因治疗等不同领域研究与应用的利器。

　　2013年，亓磊研究组在Cell发布论文介绍了课题组开发的基因沉默技术。研究人员将CRISPR用于基因表达序列特异性调控的平台，研发出了一种基于Cas9的基因调控方法。他们将这个系统称为CRISPRi，并指出这种RNA导向的DNA识别平台是基因组范围内基因表达选择性抑制的一种简单的新方法。

　　今年3月，亓磊研究组发表论文，借助于CRISPR-Cas9基因编辑方法，筛选上千个基因突变组合，寻找可以选择性杀死癌细胞的突变，从而找到癌症的弱点。研究人员设计了具有两种导向RNA的CRISPR -Cas9系统：1）靶向一个在癌症中通常发生突变的抑癌基因；2）靶向一个受到某种癌症药物破坏的基因。研究人员针对三种实验室细胞系（人宫颈癌细胞，肺癌细胞和胚胎肾细胞）中的73个基因，总共150,000种基因组合研发了这一新系统，然后他们检测了细胞的生长和死亡。结果证明，这种方法能揭示超过120种新的合成致死相互作用。CRISPR又一值得关注的华人学者 Nature子刊借助基因编辑发现癌症弱点

　　在此基础上，亓磊研究组深入研究，研发出了一种可以用于绘制哺乳动物细胞中的遗传相互作用的CRISPR干扰（CRISPRi）筛选平台。他们利用单链或双链导向RNA（sgRNA）池分别干扰个体基因或基因对的表达，从而靶向了107个人类细胞中的染色质调节因子，并且研究人员通过针对单个sgRNA或sgRNA对相对富集的分析，描述了遗传相互作用的定量特征，比对了蛋白质-蛋白质相互作用数据，从而揭示了染色质调节的功能图。

　　CRISPRi技术能抑制指定目标的转录，不论是编码还是非编码的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9），dCas9能到达引导RNA指定的位点，但无力对DNA进行剪切（Cell, 152:1173-83, 2013）。当dCas9结合到基因组的时候，会阻断转录机器的结合，阻止这一过程的进行。之后改良版CRISPRi在dCas9上连接了一个来自转录沉默子（KRAB）的结构域。这个大约50aa的添加阻碍了DNA伸展，使其难以得到转录。CRISPRi的可逆性是一种特色，不过这也限制了该技术的应用。一些研究者正在利用KRAB结构域让dCas9结合得更加稳定，以实现永久抑制特定位点的转录。人们可以通过这种方法研究表观遗传学标记的跨代遗传。

　　最新这项研究构建了一个靶向参与染色质调控的107个基因（平均每基因3个sgRNA）的单sgRNA文库，这一文库还包括41个阴性对照sgRNA和5个阳性对照sgRNA，前者不会靶向人类基因组的位点，后者则靶向已知能对细胞增殖产生强烈影响的因素。研究人员利用这一文库生成了一个可以同时靶向基因对的双链sgRNA文库。将这两个文库转染到HEK293-TetON-dCas9-KRAB细胞中，得到了两个包含单个或者两个基因干扰的细胞池，这样再通过测序，分析细胞适应度和定量表型读数。

　　这种方法相比于相比于RNA干扰（RNAi）具有多个优势，比如RNAi靶向的是成熟的RNA，CRISPRi的作用是阻止转录的起始，因此虽然CRISPR系统也存在脱靶效应，但要比RNAi少得多，因为CRISPRi必须在转录起始位点附近才能发挥作用。此外比较于Cas9介导的基因敲除，CRISPRi敲除并不会在等位基因中出现异质性，而且可以进行获得性功能筛选，这些都有助于后续的研究。