《Nature》于2019年末选出了其创刊150年历史上出版过的最具有历史影响力的10篇论文,其中包括剑桥大学的阿根廷生物学家César Milstein(色萨·米尔斯坦)和德国生物学家Georges J. F. Köhler(乔治斯·科勒)在1975年发表的文章。他们提出的利用杂交瘤细胞生产单克隆抗体(monoclonal antibody)的方法, 为此后半个世纪的免疫学以及癌症和自身免疫性疾病治疗的医学研究提供了重要的工具和思路。当时德国科隆大学(Universität zu Köln)的免疫学家Rajewsky 在为Nature 撰写的新闻稿中这么评论道:“我当时立刻意识到我们的研究领域迎来了一个转折点。”
1975年，Nature报道了如何制造能产生已知特异性抗体的细胞系。这一发现导至了在治疗自身免疫疾病和癌症方面的重要生物学发现和临床上的成功进展。抗体由B淋巴细胞产生, 可以特异性结合病原抗原并阻断病原侵染。1890 年, 德国生理学家Emil von Behring 和日本微生物学家Shibasaburo Kitasato在暴露于白喉毒素和破伤风毒素的动物血液中发现一种可以中和毒素的物质, 并将其命名为抗体(antibody)。他们引入“抗体”一词来泛指抗毒素物质，在医学实践中, 抗血清一直被用于传染病的被动免疫疗法或者检测工具。然而, 由于血清抗体的多克隆性及效价不稳定, 这些方法的效果不一, 还常受到过敏反应和血液传播病原体风险增加等问题的限制。同时，与他们合作的德国科学家Paul Ehrlich受当时关于酶与底物结合的“锁钥学说”启发, 提出抗体与毒素抗原相结合也是基于类似的化学结构原理。20 世纪20 年代, 美国免疫化学家Michael Heidelberger 和美国微生物学家Oswald Avery发现抗原可以被抗体沉淀,并揭示抗体的化学本质是蛋白质。 1948 年, 瑞典免疫学家Astrid Fagreaus发现由B 细胞分化而成的浆细胞是产生抗体的效应细胞。自被发现开始,抗体便成为了科学界一个经久不衰的研究热点。人们发现, 抗体在适应性免疫(adaptive immunity)中发挥着不可替代的核心作用, 并惊讶于抗体对各类抗原(antigen)分子兼具高度亲和力及高度特异性的结合能力。然而, 想要得到识别特定单一抗原的抗体十分困难。以当时的技术, 人们希望获得可以特异性识别流感病毒的抗体, 就需要用灭活的流感病毒来免疫模式动物(例如小鼠或兔子), 一段时间后从被免疫动物的血清中分离抗体。由于血清中大量不同抗体的存在, 这样获得的抗体成分中能够特异性结合流感病毒的一般只有0.5%~5%, 不仅特异性低, 而且可重复性也难有保障。即使使用亲和层析技术也无法纯化流感病毒特异性的抗体, 因为亲和层析无法分离针对同一抗原不同表位(epitope)的抗体。这样纯化出来的抗体也会是成千上万种针对不同表位抗体的混合物, 也就是所谓的多克隆抗体(polyclonal antibody)。这种多克隆抗体在科研临床应用有限。20 世纪60 年代, 多发性骨髓瘤(multiple myeloma)被人们发现。作为一种浆细胞来源的肿瘤, 它在人体内可不受控制地无限增殖。由于骨髓瘤细胞保持了浆细胞高效率分泌抗体的特性, 因此多发性骨髓瘤患者的血清和尿液中可以检测到大量被称为paraprotein 的抗体和抗体片段(多为IgA、IgG、λ 轻链和κ 轻链)。研究者利用骨髓瘤细胞的这一特点对抗体进行了更深入的研究, 虽然这些抗体还并非是针对单一抗原表位的单克隆抗体, 但是人们借此对抗体的生化基础有了更深的了解。肿瘤免疫学家MichaelPotter 发现, 在特定品系的小鼠体内注射矿物油可以诱发小鼠产生骨髓瘤,这为骨髓瘤和抗体研究提供了动物和细胞模型。1974 年, 毕业于瑞士巴塞尔免疫学研究所(Basel Iustitute for Immunology)的Köhler 作为一名博士后加入了Milstein在剑桥大学的实验室。当时细胞融合技术正热门, Milstein的团队尝试在一些小鼠骨髓瘤细胞系以及各种其他细胞(例如成纤维细胞)之间进行细胞融合。然而细胞融合后杂交细胞分泌的抗体特异性不佳。恰好Köhler 在巴塞尔免疫研究所攻读博士时了解到, 当时的研究所所长Niels Jerne 开发了一种可以筛选分泌单一抗体浆细胞的方法,即通过含有绵羊红细胞(sheepred blood cell, SRBC)的琼脂平板上的斑块(plaque)来筛选分泌针对SRBC单一抗原抗体的浆细胞。分泌识别SRBC 抗体浆细胞团簇周围的红细胞会因为抗体结合后的作用而发生细胞裂解, 从而形成一块肉眼可见的没有红色斑块的区域。但是由于缺乏永生性,这些能够分泌单一性抗体的浆细胞无法被培养, 进而无法实现抗体的大规模生产。因此, Köhler 和Milstein 想到, 如果能够将分泌单一抗体的浆细胞和无限增殖的骨髓瘤细胞融合, 就可以一举解决稳定持续大量地生产单一性抗体这一难题。Köhler 和Milstein 的实验设计获得了成功——当他们把注射了SRBC 的小鼠脾脏细胞取出, 与P3-X67Ag8骨髓瘤细胞系融合, 并在含有SRBC 的琼脂平板上培养后,在没有红色斑块的区域分离出了大量既像浆细胞一样分泌抗SRBC 抗体又像骨髓瘤细胞一样具有永生性的融合细胞。在他们使用的HAT 培养基中, 由于氨基蝶呤(aminopterin)阻断了DNA 核苷酸的从头合成途径, 细胞必须利用自己的DNA 核苷酸补救合成途径以及培养基中的次黄嘌呤(hypoxanthine)和胸腺嘧啶(thymidine)才可以生存。但是这里使用的骨髓瘤细胞系缺少DNA 补救合成途径中的必要酶, 即次黄嘌呤- 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase, HGPRT), 因此无法正常增殖, 脾脏细胞则本身不具有永生性。这样, 能够在他们设置的培养条件下正常增殖的细胞, 必然是既拥有HGPRT, 可以正常合成DNA, 又具有无限分裂特性的融合细胞。当然他们这样设计的实验能够成功, 有一定运气,后来人们知道骨髓瘤细胞明显倾向于和脾脏细胞融合, 而不是发生自体融合。Köhler 和Milstein 培养出的融合细胞被称为第一代杂交瘤(hybridoma)细胞, 可以进行无限的培养、增殖和抗体分泌。但是在技术层面, 由于他们当时使用的P3-X67Ag8骨髓瘤细胞系会内在性地分泌自身基因组编码的抗体, 因此第一代杂交瘤细胞分泌的浆细胞来源特异性抗体中会掺杂骨髓瘤来源的非特异性抗体。不过很快地, 一类不会内在性地分泌骨髓瘤来源非特异性抗体的X63-Ag8.653 骨髓瘤细胞系被免疫学家Rajewsky 的研究团队成功分离。使用X63-Ag8.653 骨髓瘤细胞跟来自脾脏的浆细胞进行融合,很好地解决了第一代杂交瘤细胞培养上清中两种抗体混杂的问题。从此,可以高度特异性结合人们需要的各类抗原的单克隆抗体终于可以在体外被制造出来, 并在实验室研究和医疗应用中得到了极大的应用。 1984 年, Milstein、Köhler 和发现骨髓瘤诱导产生方法的Potter 被授予生物医学领域知名的拉斯克奖, 同年的诺贝尔生理学或医学奖则被颁给Milstein、Köhler和发明平板筛选SRBC 特异性抗体方法的Jerne。
非常值得一提的是,剑桥大学Milstein 实验室在单克隆抗体技术投入应用后毅然放弃了这些技术的ZL权, 使得全世界的研究者和病人不需要支付额外的ZL费用就可以享受使用单克隆抗体技术生产的试剂和药品。为此,Milstein 曾说过, “只有当世界上真正穷苦的人们也能平等地分享科学带来的好处时, 科学才算是兑现了它的诺言”。 Milstein 的义举, 在物质至上的社会, 也的确引起一些争议。后来有推测或许是因为Milstein出生于1927 年社会动荡的阿根廷,这些成长早期的社会经历使得Milstein真正理解并不宽裕的广大人民群众对科技进步带来的相关成果的急迫需求。
自小鼠杂交瘤技术诞生以来,单克隆抗体技术在过去45 年间取得了长足的发展。其中, 最显著的是多种各具特色的抗体筛选技术的出现, 为制备单克隆抗体提供了更多的选择。此外, 强烈的临床需求还催动了更高效的以人源抗体为目标的单克隆技术的发展。噬菌体展示技术作为第一种可以高通量筛选对特定病原体反应抗体的创新方法, 其主要技术流程包括: 从被免疫或感染后的人体外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)提取细胞总RNA, 并反转录成cDNA; 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段, 随后将扩增的基因片段随机克隆形成组合文库; 将组合文库导入丝状噬菌体(filamentous bacteriophage)与外膜蛋白融合表达; 用固相化抗原直接、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体基因序列, 经体外加工形成全人源抗体。这个技术为抗体定向演化提供了全新策略, 从根本上改变了传统杂交瘤技术制备流程, 一次筛选可获得针对同一抗原不同表位的多种抗体, 缩短了实验周期并增加了稳定性。因此, 噬菌体展示技术于2018年被授予诺贝尔化学奖。但该技术也有明显缺点: 它对抗体蛋白的修饰和折叠与人体细胞差别很大, 一定程度上影响了抗体的亲和力。因此, 噬菌体展示技术获得的抗体往往还需要人工优化。酵母展示技术实现了从原核表达系统到真核表达系统的进步。酵母菌具有折叠酶、分子伴侣、内质网等, 在蛋白质的折叠和分泌机制方面与高等哺乳动物相似, 基于此建立起来的酵母表面展示技术可用于展示糖基化和二硫键异构化等修饰的真核生物蛋白质, 有助于提高展示抗体的稳定性和抗原结合能力。并且, 利用流式细胞技术还能对表达抗体的酵母颗粒进行分选, 达到高效、快速的筛选和分离。不过酵母的蛋白质修饰系统与人体依然有不小的差异, 这对抗体功能仍存在一定影响。中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary, CHO)细胞是目前用于真核基因表达的最成功的哺乳动物细胞, 在生物工程上被广泛应用。与噬菌体展示技术相比, 外源蛋白更易在CHO 细胞中合成并分泌到培养基; 重组蛋白能够正确折叠、修饰、组装多亚基蛋白, 并且其理化性质、生物学性质几乎与天然蛋白相似, 这在生物技术的发展中具有很高的应用价值。但外源基因在CHO 表达系统中的表达效率比在酵母展示系统中低且重组蛋白的生产成本较高。核糖体展示技术由Plückthun 实验室于1997 年建立。该技术通过PCR 扩增淋巴细胞cDNA 中的VH 和VL 基因并引入体外表达元件方式构建文库, 然后在体外无细胞体系中转录和翻译。由于构建模板时3′端序列不含有终止密码子, 因此体外翻译时核糖体停留于mRNA 的3′端, 使文库基因的翻译产物展示在核糖体表面, 形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物。最后用靶抗原反复筛选复合物、分离mRNA、逆转录富集目的基因, 从而获得特异性的单克隆抗体序列。与其他展示技术相比, 核糖体展示具有建库简单、库容量大、分子多样性强、筛选方法简便、无须选择压力, 还可通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点, 是一种筛选大型文库和进化抗体强有力的方法。如何进一步提高该系统的稳定性, 防止mRNA 降解, 则是该技术需要解决的关键问题。
