单克隆抗体的克隆化方法

实验原理

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。

克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。

实验步骤

1. 有限稀释法

1) 材料

a. 微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞(即饲养细胞)每孔2万～4万。

b. HT培养基

2) 操作方法

a. 取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。

b. 用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。

c. 用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。

d. 5％CO2饱和湿度，37℃培养。

e. 每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。

f. 克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。

g. 抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。

2. 软琼脂克隆化

借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：

1) 配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

2) 将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。

3) 将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。

4) 每块平皿加10ml，于室温中凝固。

5) DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。

6) 放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。

7) 用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。

8) 用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。

3. 显微镜操作法

在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口(一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入)水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。

4. 荧光激活分离法

用一种荧光激活细胞分类器(Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS)。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。