1.材料(1)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
20mMol/LNaCl
(2)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
40mMol/LNaCl
(3)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
80mMol/LNaCl
(4)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液
(5)饱和硫酸铵液
(6)DEAE—纤维素柱
2.操作方法
(1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后,于1.00×105转离心30min,去沉淀。
(2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使溶液最终为50%硫酸铵浓度。
(3)此溶液置冰中30min~60min,然后5000r/min离心10min,去上清。
(4)将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/LNaCl)中(溶液可能混浊)。
(5)装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20mMol/LNaCl)中透析除盐。
(6)离心去沉淀。(7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后,于280nm测蛋白含量,估计蛋白质含量1A280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中,含有总蛋白约25mg~36mg。
(8)过DEAE—纤维素柱:纤维素柱高40cm,以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。
样品进入柱床速度为1ml~2ml/min,以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用。
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