单克隆抗体的提纯实验

　　1．材料(1)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

　　20mMol/LNaCl

　　(2)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

　　40mMol/LNaCl

　　(3)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

　　80mMol/LNaCl

　　(4)20mMol/LpH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液

　　(5)饱和硫酸铵液

　　(6)DEAE—纤维素柱

　　2．操作方法

　　（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。

　　（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50%硫酸铵浓度。

　　（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5000r/min离心10min，去上清。

　　（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/LNaCl）中（溶液可能混浊）。

　　（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20mMol/LNaCl）中透析除盐。

　　（6）离心去沉淀。（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。

　　（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/LNaClTris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。

　　样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。

　　杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。