单细胞技术在药物筛选中的应用

单细胞的异质性会被组织等高通量细胞样本的均质化生信数据覆盖以致难以凸显，尤其是在临床诊断中。所以开发应用单细胞技术在发现甚至筛选药物靶点成为了有力的手段之一。

苏州系统医学研究所李贵登课题组、加州理工学院的David Baltimore课题组和西雅图系统医学研究院的James Heath课题组在综合性一区期刊Nat Communications（IF:12.121）发表的“Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line”的文章。运用单细胞蛋白质组和代谢组联合分析发现并验证了细胞在药物作用过程中展现出的异质性，这为单细胞技术在药物靶标筛选方面提供了新的指导。

单细胞多组学揭示了黑色素瘤细胞系耐药的多个独立路径

研究背景

已经有较多的研究证明药物对机体细胞状态的影响能够从信号转导、代谢物改变、表观遗传等水平上展现出来，但是对于单个细胞的的变化仍然研究不充分。

文中选用了一种高度可塑性的癌细胞系（BRAF V600E），当用靶向抑制剂治疗时，它在几天内从快速分裂的药物反应状态转变为药物耐受的缓慢循环状态。结果表明，细胞确实可以在两种状态之间采取多种轨迹。每个路径类别都有一个独特的信号和代谢网络，具有不同的药物敏感性。

研究思路

 使用单细胞Barcode芯片对BRAF抑制剂（BRAFi）处理了不同时间（0天、1天、3天、5天）的样本进行了蛋白质组学和代谢组学分析。

结果速递

 1：BRAFi处理后的单细胞蛋白质组学和代谢组学分析与对照组（Day0）相比，某些分析物在整个细胞群中表现出高度可变性。包括黑色素细胞瘤转录因子（MITF、MART1）、代谢调节因子HIF1α和p-AMPKα，以及增殖标记因子Ki67。在加药初期，葡萄糖摄取，大多数代谢调节因子和磷酸化蛋白以及Ki67表达受到抑制。在Day5组出现了药物耐受，即与药物抗性相关的因子表达量有所升高，如NGFR、TNFR、N-cadherin、AXL。

通过对单细胞蛋白质组学和代谢组学的联合分析，发现了细胞先是对药物有了初始反应，后续诱导了细胞状态的变化，然后出现了药物耐受的情况。

图1 M397细胞早期药物反应的单细胞蛋白质组学和代谢分析

2：降维分析发现药物处理后细胞不同状态的多重路径文章选用了三种降维分析算法：FLOW-MAP、t-SNE和PHATE展示了药物处理后细胞中代谢物随时间的协调变化。

通过FLOW-MAP实现单细胞数据的可视化发现：D1时期，大多数细胞聚集在D0细胞的右上方，有小部分分布在D0的右侧。随着时间的延长，D3时候，更是如此，到D5时，所有的细胞都汇集到图形的右侧。这D1和D3细胞的分叉状态表明了细胞耐药过程中可能有两条通路发生了变化。

图2 降维分析数据结果

3：Surprisal分析解释两种不同路径的聚集模块

20种代谢物的聚集类型通过Surprisal分析得到了两种耐药性发展模式（图3a）。这两种模块都显示出明显的两种不同路径，说明其中存在一个生物屏障。尤其是黑色素瘤细胞表型转录因子MITF及MART1的表达与模块2 的评分呈现负相关表达（图3b）。后随即将细胞根据MITF的表达分为两种（MITF-LOW/HIGH），并挑选了四种不同的代谢物进行了用药后表达量的分析（图3 h i）。结果表明，即使是相同的细胞系，在经过BRAFi处理后表现也不尽相同。

图3 Surprisal分析表明MITF是不同路径发生的关键因子

4：通过临界点分析确定不同路径的关键因子

这两种模式都表明细胞从药物敏感型状态到耐药性状态转换的过程中存在着关键临界点。因此，文章将所有时间点的单细胞数据进行分类。通过信号网络活动指数(SNAI)和关键转换指数(Ic)分析，第7亚类和第9亚类有可能是各自路径中接近临界点的细胞状态（图4 b c）。

为了找到驱动细胞状态转变的关键调控因子，文章对第7和9亚类的临界点代谢物进行了网络分析和重要性得分分析（图4 d e f）。

图4 两种路径的临界点分析和网络分析

5：验证导致两种不同路径的关键物质

为了确定细胞在药物治疗从敏感性转至耐药性的两种可能路径中的关键因子，文中选用了PKM2抑制剂（PKM2i）和NFκB抑制剂（NFκBi）联合BRAFi治疗分选得到MITF-LOW/HIGH细胞亚群，结果发现MITF-LOW组对NFκBi+BRAFi组合更敏感，MITF-HIGH组对PKM2i+BRAFi组合更敏感。同时在MITF敲除的M398细胞系中显示出了一样的结果。然后文中选用三种抑制剂的不同组合形式对M397进行耐药性的实验，发现三种抑制剂的疗效明显优于两种抑制剂和单独一种抑制剂的疗效。以上结果表明细胞在不同路径中对PKM2i和NFκBi表现的敏感性不同，说明这两种通路是独立的，有不同的调节物质在通路中起关键作用。

图5 细胞中与不同通路相关的药物敏感型差异

小结：本文选用单细胞多组学技术解析了细胞耐药的异质性反应轨迹，更新了目前对耐药性发展的认识，为确认有效的治疗组合提供了强有力的方法学。