单链抗体的噬菌体展示技术

基 本 方 案 1 全套单链抗体噬菌体载体的构建

材 料

新鲜分离的小鼠脾脏或者 IO7 杂 交 瘤 细 胞（单 元 1*3)

R N A 提取试剂

R T -P C R 试剂

D E P C 水

寡 核 苷 酸 引 物（表 14. 3.1)

DNA marker

琼脂糖胶回收试剂盒（Qiaquick Gel Extraction kit， Qiagen)

10m m o l / L Tris • C U p H 8. 5

Vent D N A 聚合酶

d N T P (由 R T -P C R 试剂盒提供）

P C R 缓 冲 液（由 R T -P C R 试剂盒提供）

噬 菌 粒 载 体（如 P C A N T A B 5E )
限制酶 S / il、 及相应缓冲液

B S A

T 4 D N A 连接酶和 10X 连接缓冲液

电转感受态菌£：coli T G - I
S O C 培养基

Y T A G 琼脂平板： Y T 培养基， 2 X (附 录 1 ) 含 0 . 4 % 葡萄糖， 100/xg/m l 氨苄青霉素

Y T A G 培养基： Y T 培养基， 2 X ，含 和 不 含 15% (V A O 甘 油 ， 100/xg/m l 氨苄青霉素

P C R 仪

I.5m l 微量离心管

电穿孔仪器

0.2c m 容器

13c m 无菌离心管

接种环

1 . 用 R N A 提取试剂盒提取脾脏或者细胞的总 R N A 。溶 解 在 0.5 ml D E P C 水中 ，作为R T -P C R 模 板 。剩 佘 的 R N A 分 装 成 50M 1/管 ，一 70℃ 保存。

2 . 根 据 R T - P C R 试 剂 盒 说 明 配 制 4 管 48/xl 反 转 录 反 应 体 系 ，每 管 包 含 20/xg 的总R N A ， 0. 5 ug oligo d T 。 95°C 孵 育 I O m i n 后放于冰上终止反应。

3 . PCR扩增：每 管 加 入 下 列 引 物 混 合 物（表 14.3.1)，引物的终浓度为 50pmol/50ul反应体系，总体积为 2m l 。

管 1 : 引物Mu-VH1-6-BACK(引物 NO.1〜6，根据表 14.3.1 的比例混合）和引物M u -J H l - F O R (S ) (引物 N o .10)。