原代肾上皮细胞培养实验

将自皮质切除的组织快切成碎块，冲洗后放入胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液，摇晃消化。定时用吸管研磨组织块，然后收集分离的细胞。用一定孔径大小的滤网过滤细胞悬液，除去未消化的组织块。然后，洗细胞，清除消化酶。用添加血清的培养液混悬细胞，将细胞接种于塑料培养器皿。

肾组织片

DMEM FBS 胶原蛋白酶 胰蛋白酶

手术刀 组织镊 有轨振荡器 培养皿 培养瓶 试管 滤网

一、材料

无菌

1. 基础培养液：DMEM 和 F12 混合液 50：50

2. FBS（Sterile Systems, Hyclone)

3. 完全培养液：DMEM 和 F12 混合液，添加 10%FBS

4. BSS

5. 0.1% 胶原蛋白酶（IV 型，Worthington）和 0.1% 胰蛋白酶（1：250，Sigma）混合液，用 0.15mol/L NaCl 配制

6. 0.5 mg/ml DNase，用生理盐水配制

7. 胰蛋白酶和 EDTA 混合液：用 0.1% 胰蛋白酶（1：250）和 1 mm/L EDTA(培养基，Sigma）配制

8. 手术刀和组织镊

9. 孔径为 160um 的 Nitex 滤网（Tetko）

10. 培养皿和培养瓶

11. 50 ml 试管

非灭菌

1. 有轨振荡器（Bellco）

二、操作步骤

消化组织

1. 按冠状面将肾切成 5~10 mm 厚的组织片。用冰冷的基础培养液洗组织片。

2. 从皮质的外层切下组织，然后用十字刀片切成 1~2 mm 小块。

3. 将约 5 ml 组织块放入盛有预热的 20 ml 胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液的 50 ml 试管。

4. 轻轻摇晃，孵育组织块 1 h。

5. 吸除消化液，然后加入新鲜消化液。

6. 每隔 20 min 收集细胞悬液，然后加入 20 ml 含有 0.5 mg/ml DNase 的培养基础液，用 10 ml 吸管轻轻研磨 10 转。

7. 用等量的完全培养液稀释收集的细胞悬液。将稀释后的细胞悬液置于冰上。

8. 重复收集步骤 5 次或 5 次以上，直至组织块被完全分散。

9. 将收集的细胞悬液混合，分装如 50 ml 试管，

10. 离心（100 g，15 min）后，用 45 ml 含 DNase 的完全培养液混悬细胞。

11. 用孔径为 160um 的 Nitex 滤网过滤细胞悬液。

12. 这种分离方法既分离到系抱团，又分离到单个细胞，故细胞计数不可靠。每个 75cm²培养瓶内放 15 ml 细胞悬液，细胞扩增后传代培养或冻存。                                                                  

1. 在原代培养初期，培养液的含量在3ML以下，最适宜的为1-1.5ML，仅够保持植块湿润即可。

2. 在扔入垃圾前，应该用次氯酸盐处理剩余组织和使用过的试管、吸管、培养皿。

3. 培养液需要在无菌的环境下才能打开，避免污染。

肾小管上皮细胞的鉴定：将培养的肾小管上皮细胞置于放有盖玻片的24孔培养版上，待细胞生长至占有培养面积约80%时，取出盖玻片，PBS洗片。甲醇-20摄氏度固定5min，PBS洗片，加10%羊血清37℃封闭30min，PBS洗片，加兔抗人角蛋白18抗体，阴性对照PBS一抗，37℃反应1h，加FTTC标记的羊抗兔lgG（1:200），37℃避光反应45min， PBS洗片，90%甘油封片，荧光显微镜观察染色结果。

NHK-C细胞显著呈现近曲小管的功能特征，如受甲状旁腺激素（parathy roid houmone，PTH)抑制的Na+依赖性无机磷转运系统。另外NHK-C细胞转运己糖，这种转运对根皮苷敏感和具有Na+依赖性。NHK-C细胞的cAMP受激索刺激方式同近曲小管，即对PTH反应，对加压素不敏感。这些细胞表达近曲小筲刷状缘的酶（表芽糖酶、亮氨酸氨基酞酶和7-谷氨酰转酞酶）。此外，NHK-C细胞用于研究磷酰基甲酸的特异性和Na⁺和 P同向转运的抑制剂，并作为肾小管氧化剂损伤的模型。

来源：《动物细胞培养：基础技术指南（第五版）》