原理易懂然而难做，qPCR结果分析的常见问题

　　qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。数字PCR（dPCR）的基本工作原理很简单，先将样品划分为多个PCR反应，每个反应最多只含有一个模板。然后通过计数正负反应来确定初始样品中模板分子的数量。

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　　qPCR分析的常见问题

　　1. 无Ct值出现

　　检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。

　　引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。

　　模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

　　模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

　　2. Ct值出现过晚（Ct>38）

　　扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

　　PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

　　PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

　　3. 标准曲线线性关系不佳

　　加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

　　标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

　　引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

　　模板中存在抑制物，或模板浓度过高

　　4. 负对照有信号

　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。

　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　5. 溶解曲线不止一个主峰

　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

　　6. 扩增效率低

　　反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

　　反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

　　反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

　　7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

　　判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性

　　如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

　　8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？

　　参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)

　　模板的浓度太高或者降解

　　荧光染料的降解