基于徕卡THUNDER高对比度成像技术的转基因斑马鱼胚胎筛选应用流程

　　摘要

　　本应用报告介绍了如何利用徕卡显微系统的DM6 B显微镜平台及其集成的THUNDER高对比度成像技术，建立一套高效率、高对比度、适用于低表达蛋白检测的斑马鱼胚胎筛选流程。该技术基于徕卡的光学成像系统，可显著降低厚样本的焦外模糊，提升图像对比度。THUNDER与徕卡的SynapseTM高速触发系统、8通道LED照明和K8 sCMOS相机协同工作，形成一套便于抽取信息、适用于动物模型筛查的标准化成像方法。

　　1.品牌与技术背景

　　1.1 徕卡显微系统简介

　　徕卡显微系统是一家专注于光学显微成像、数字成像解决方案和样本分析技术的专业制造商。其核心技术体系包括集成于成像平台中的THUNDER高对比度成像技术、LIGHTNING反卷积、高端物镜平台以及sCMOS相机。

　　1.2 THUNDER技术定位

　　徕卡THUNDER是一种集成于其光学显微镜平台的高对比度成像技术，专为厚组织与3D培养物设计。该技术通过实时处理，能有效去除由厚样本散射引起的焦外模糊，从而显著提升图像的荧光对比度，特别适合斑马鱼胚胎这类厚度较大、散射显著、荧光表达差异大的样本。

　　2.应用背景：斑马鱼胚胎筛选的挑战

　　2.1 行业需求

　　转基因斑马鱼胚胎广泛应用于发育生物学与体积成像实验（如光片显微镜）。筛选是否具有足够蛋白表达，是进入下游三维成像前的关键步骤。

　　2.2 传统技术的局限性

　　体视显微镜：分辨率和灵敏度不足，低表达样本容易被漏判。

　　传统宽场显微镜：厚样本下焦外模糊严重，导致对比度下降。

　　因此需要一种高对比度+低光剂量+高速切换+可靠检测低表达信号的成像系统，而这正是徕卡THUNDER的优势所在。

　　3.徕卡 DM6 B + THUNDER的筛选方法与工作流程

　　3.1 使用设备

　　● 徕卡DM6 B宽场显微镜

　　● 集成THUNDER高对比度成像功能的图像处理模块

　　● 徕卡K8 sCMOS相机

　　● 徕卡SynapseTM高速触发系统

　　● 徕卡pE800 8通道荧光光源

　　● 徕卡HC APO/HC FLUOTAR系列高数值孔径物镜

　　3.2 操作流程

　　步骤1：样本安装

　　将斑马鱼胚胎置于35mm培养皿，适配THUNDER Imager Tissue平台。

　　步骤2：低倍概览

　　使用徕卡1.25x/0.04干式物镜进行明场概览观察。

　　步骤3：LAS X Navigator导航

　　使用徕卡LAS X Navigator软件标注需要进一步筛查的ROI。

　　步骤4：高倍确认

　　切换到高分辨率物镜，配合低光照、短曝光与高速触发，确保内源荧光不受光漂白影响。

　　步骤5：启用THUNDER高对比度成像模式

　　在徕卡LAS X软件中开启THUNDER成像模式：

　　● 基于徕卡光学系统获取的图像数据，实时去除焦外模糊

　　● 增强低表达蛋白的信号可见度

　　● 在预览阶段即可获得清晰图像，用于快速判断

　　4.筛选结果与表现

　　4.1 对比度提升显著

　　徕卡THUNDER高对比度成像技术能显著降低由厚样本引入的焦外模糊，使荧光结构边界更清晰，背景噪讯得到有效抑制。

　　4.2 低表达信号也可稳定检测

　　徕卡K8 sCMOS的高灵敏度与THUNDER成像技术的背景抑制能力相结合，可在低光照条件下获得高信噪比的图像，非常适合低表达蛋白筛查。

　　4.3 全流程高效衔接

　　“徕卡DM6 B显微镜平台 → Leica LAS X Navigator软件 → 集成的THUNDER成像功能”形成连续、快速、可视化强的筛查链路。

　　5. 应用场景案例

　　以下流程均由徕卡显微系统成像平台实施：

　　● 使用具备THUNDER成像功能的徕卡THUNDER Imager Tissue系统进行低倍概览与荧光筛查

　　● 以徕卡K8 sCMOS相机在555 nm、2% LED强度、150 ms曝光条件下成像，并通过THUNDER模式实时增强mKate信号对比度

　　● 研究团队成功在低表达条件下识别目标胚胎，减少无效样本进入下游光片体系

　　6. 结论：徕卡在斑马鱼筛选中的价值

　　徕卡DM6 B显微镜与其集成的THUNDER高对比度成像技术为斑马鱼胚胎筛选提供：

　　● 高对比度、可复现的荧光成像

　　● 对低表达蛋白的稳定检测能力

　　● 高速操作流程

　　● 低光损、适用于后续活体成像工作流

　　● 适配多种徕卡物镜的灵活扩展性

　　此方法可显著提升实验流效率，并为光片显微镜等3D培养物成像方式提供高质量样本筛选。