基因表达RTPCR之我见

本文讨论的范围包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容，希望对大家有用。

基因表达的定义：说到基因表达，是指RNA，还是蛋白？是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA？mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平，而蛋白应该叫翻译水平？我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测吧！ 

方法：很多很多，我们常用的也就是RT-PCR和northern。RNA没保护分析在国外很常用，也有半定量的功能，一次性试剂盒还能以此将一个表达簇一起分析，例如NFkB的转录激活谱中的8个常见基因。dot blot的zui大贡献是发展到了反向dot blot的顶峰――曾经无限时髦的基因芯片，而原位杂交的放大效应和它的假阳性使它的定量（半定量，应该根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意义不可同日而语，又难做，只有新发现的基因可以在没有得到蛋白和抗体的情况下进行组织或者细胞定位。

先谈谈RT-PCR吧。关于原位杂交和 dot blot大家可以和我论战的，我曾经看到一篇公开发表的文章把dot blot称为定量检测，是极端错误的。

1、模板均一性问题：愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR的本身的敏感度，即便是在反转录就有差异，到了cDNA的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然在反转录阶段我们也经常控制在1或5ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能地利用反转录酶，而且RNA定量本身即使用电泳也不是那么准，更不要说分光光度计，这里说一下，我曾经看到有人说用分光光度计定量，这也不是很准确，分光光度计只是掌握大概，当然用于反转录足够了，但是用于rt－pcr的定量这是不正确的，很不准的，RNA也zui好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。 

2、RNA制备：一般制备总RNA 即可，有时需要制备mRNA，个人认为初学者还是选择Trizol，大量制备采用传统的方法自己配，实际上和trozol一样的，有时效果还好，trizaol也就是混一混，但是优点在于质量保证，使用方便，效率高，根据不同组织用trizol一般可以提到全部RNA的50%（别小看，这已经很高了）以上，有些可以到达80%。mRNA用Qiagen的柱子，别去自己做Oligo（dT）柱，太麻烦。是否用DNAseI根据基因的特点和引物的设计，能够跨内含子的就不需要处理，处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验，并且如果牵涉到样品是无价之宝的时候，因该选好的进口试剂。谈到RNA的贮存实际上主要是温度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要说在胍里了，只－20是不够的，至少－80，液氮zui保险，想想，在低温里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一种easy产品可用于保存标本，但在常温也只是1天，所以低温才是首要的，抽的时候也是这样。 

3、反转录：常规，取样尽量一致，如上所述，不是为了定量，是为了半定量PCR时图形的好看。选择逆转录酶根据实验需要，少量的可用 Promega的一种1ug的酶，多的我们用invitrgen的5ug的II，当然有人说Promega和Roche的也不错，用过，的确可以，要不 Invitrogen不像当初Gibco时那么牛了，也降价打折了。反转录成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你还曾经72度灭活呢，是不是？要知道，杂合双链比DNA双链还稳定的。一般来说要扩增从反转录到PCR全过程的长达2kb以上的片断是相当困难的事，很多长基因是通过随机引物库得到的而不是通过oligo （Td）得到的，不要说反转录,即使是PCR也是很困难的，不信可以从质粒里试试,至于反转录，就更是天方夜谭了，除了酶的效率等,还有RNA的二级结构等因素，这就要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.听天由命吧。