基因的重组连接技术

DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和T4DNA联接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA联接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与DNA片断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在AFLP、文库构建、PCR片断的克隆等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外源DNA与载体的连接是承上启下的一步操作，根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的T－载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。下面拟通过T4DNA联接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一DNA片段的连接操作技术。

A：溶液中连接

一：仪器离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器

二：试剂

T4DNA联接酶

10×T4DNA联接酶缓冲液

200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT

500μg/ml ／牛血清白蛋白(可不用)

λDNA/HindIII 酚/氯仿、 酚、氯仿、TE缓冲液、电泳缓冲液、3M NaAC(pH 5.2)

三:操作：

1:取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液

T4DNA联接酶缓冲液 1ul

载体DNA片断 1ng

插入目的片断 Xng

连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u)

加无菌水到 10ul

X=目的片断与载体片断的分子比例×载体ng数×目的片断的碱基数/载体ng数

（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1）
2:连接反应

22℃保温3小时或4℃过夜(Promega连接酶,粘端连接)

或22-26℃1hr(BRL连接酶,粘端连接)

或22℃4-16hr(Promega连接酶,平端连接)

或14℃16-24hr(BRL连接酶)

B：胶内连接：
该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外源DNA片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入缓冲液、载体DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因组片断也可为PCR片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的DNA量、载体量及酶量都要增加。

一：仪器：同A

二：试剂：同A

三：操作

1：低熔点琼脂糖胶分离外源DNA片断，在紫外灯下切下目的片断

2：65℃保温彻底溶化琼脂，取18ul（约0.1-0.5ug）于一新管内再加入2ul载体（约0.01-0.05ug）混匀，37℃5－10min

3：配制2×T4DNA连接酶反应体系20ul，（其中含2×T4DNA连接酶缓冲液和不低于2uT4DNA连接酶）混匀，点动离心后置于冰浴

4：将预冷的2×T4DNA联接酶反应体系20ul加到“2”中含待连接DNA样品管中立即混匀后立即置于冰浴中待凝固

5：置于12℃连接过夜。

6：此连接片断可直接用于转化，即转化前65℃溶化，取5－10ul转化。

注1：粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应>0.5ug。拈连时温度可在4℃过夜，而平连时最好在12－16℃过夜

2：用于转化的连接片断最好不要冰冻

3：胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。

4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。