多种工具带你走进糖蛋白的神秘世界

　　继基因组学和蛋白质组学之后，糖组学逐渐受到了人们的重视。糖组学关注的焦点是糖蛋白，糖蛋白上以共价键连接着各种聚糖，这些聚糖参与了细胞的许多关键活动（例如信号传导和细胞粘附），有着重要的生物学和医学意义。举例来说，抗体上的聚糖“影响着抗体的生物活性、药代动力学和稳定性，”Janssen制药公司的科学主管T. Shantha Raju说。

　　绝大部分糖蛋白可以分为两类，N-连接糖蛋白和O-连接糖蛋白。在N-连接糖蛋白中，糖链与蛋白的天冬酰胺残基（N-糖苷键）以共价键相连。而O-连接糖蛋白的糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基相连（O-糖苷键）。

　　糖蛋白的聚糖成分非常多变，但其中的规则却鲜为人知。人们无法根据给定的糖基化位点，判断与之相连的聚糖种类。实际上，同一个糖基化位点在不同时间点可以连接不同结构的糖链。

　　与其他“组学”研究相比，糖组学研究特别复杂，这愈发凸显了研究工具的重要性。从电泳到串联质谱，现在糖蛋白的分析工具越来越精良，人们对这些复杂分子的理解也越来越深入。本文介绍了一些糖蛋白研究的常用工具和前沿技术，希望能帮你轻松走进糖蛋白的神秘世界。

　　糖组学工具

　　糖蛋白大多位于细胞表面，属于水溶性不好的膜蛋白。目前研究者们主要通过透析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化糖蛋白。

　　据Sigma-Aldrich公司的Robert Gates介绍，分析糖蛋白上的聚糖主要有两种途径：将糖链从蛋白骨架上释放出来，然后研究游离的聚糖；或者消化糖蛋白，生成糖肽以便进一步研究。

　　糖链释放主要有酶释放和化学释放两种方法。酶法释放比较简单，条件也很温和，还能够为人们提供大量的信息，因此很受欢迎。N－糖肽酶F(PNGase F)就是释放N－糖链常用的一种酶。然而，目前还没有合适的酶来释放O-糖链，人们只能采用化学释放法。

　　化学法主要是肼解法，这种方法对N－糖链和O－糖链均适用。但肼解法的反应条件比较剧烈，之后还需要复原处理，而且蛋白部分已经破坏，无法进行糖基化位点的相关研究。

　　N-聚糖制备一直是一个低通量的过程。不过，ProZyme公司开发的GlykoPrep™糖样品快速制备平台可以使通量大大提高。该产品使用安捷伦的AssayMAP™小柱，可以在三个小时以内消化和回收多至192个样本。“在此之前，人们完成这一流程需要三到四天，”ProZyme公司的Justin Hyche说。

　　释放出聚糖之后，一般需要给它们添加荧光标签，而这一过程要用到有毒的还原剂氰基硼氢化钠，QA-Bio 公司的创立者Mike Gibson说。为此，QA-Bio 公司开发了一种使用无毒害还原剂（甲基吡啶硼烷）的LudgerTag聚糖标记试剂盒。

　　目前，微量糖链分析首选高效液相层析(HPLC)法，因为这种方法上样量少、灵敏度高、重现性好、速度快而且可实现自动化。对已标记的聚糖进行高效液相层析，可以获得独特的糖型glycoform，Gibson说。人们可以在此基础上获得聚糖的多种信息，例如通过数据比对确定聚糖所含的单糖量。

　　凝集素（Lectins）是能够特异性结合糖链的天然蛋白，可以被用来富集某种糖蛋白/糖链，也可以检测聚糖是否含有某种特定结构。它们就像抗体一样，可以同时起到捕获和检测的作用，市面上有大量的凝集素产品可供选择。

　　除此之外，还有一个常用的聚糖分析技术：通过外切糖苷酶实现的“测序”分析。这种酶能够特异性切割末端糖基，为人们揭示聚糖的单糖组成。你可以从各大供应商买到外切糖苷酶和相应的标准品，当然你也可以选择经过优化的试剂盒产品，例如QA-Bio公司CarboSeq™ N试剂盒，以及ProZyme公司的FACE® N-Linked Oligosaccharide测序试剂盒。

　　释放后的聚糖能够为人们提供丰富的信息，“你可以了解唾液酸化、岩藻糖基化的情况。还可以确定某种聚糖是属于高甘露糖型还是杂合型，”加州大学的Carlito Lebrilla教授说，他主要对分离的聚糖进行质谱分析。

　　糖蛋白组学工具

　　为了确定聚糖的结合位点（糖基化位点），研究者们往往会先用蛋白酶将糖蛋白切割成为质谱可用的糖肽。N-聚糖的糖基化位点是一个保守序列比较容易分析，但O-聚糖就没有这样的序列。

　　使用特异性的蛋白酶（如胰蛋白酶）能够“在特定位点获得非常好的异质性”Lebrilla说，但是这种方法得到的结果并不全面，不能覆盖到所有的位点。另一方面，用非特异性蛋白酶（例如pronase E或cathepsin）能将蛋白切割成更小的片段，提供更好的覆盖度。但这又会让“质谱仪很难解读”，Lebrilla说。

　　Lebrilla习惯把多孔石墨化碳柱（PGC）与质谱结合起来使用。“PGC可以帮你将同分异构体分开”，单靠质谱是做不到这一点的。他有时还会在此基础上增加一个维度的分析，比如离子迁移分离。

　　New Hampshire大学的Vernon Reinhold指出，“全面测序只能通过串联质谱MSn实现”， 其他方法（HPLC-MS或MS/MS）只能得到“一系列建立在推论上的结果”。

　　在研究糖蛋白时，每次都从头分析结构显然是不现实的。为此，研究者们希望尽快建立起可供搜索的糖蛋白文库，以便在此基础上进行快速的鉴定。幸运的是，这个工作虽然艰巨但并非是天方夜谭。据估计，人体内的N-聚糖结构还不到五千种，其中约有一百种占到了总量的99%。