多肽融合标签的移除策略

谢浩 杨程 陈丽娥
(武汉理工大学生物科学与技术系，武汉430070)
摘要：多肽融合标签能够赋予目标蛋白新的特性，便于目标蛋白的定位、追踪、纯化以及结构和相互作用研究．但在很多情况下，尤其是研究蛋白质结构或分离纯化药用蛋白时，需要将多肽融合标签从融合蛋白上切除，以降低和消除多肽融合标签对目标蛋白结构和功能的影响．可用来切除多肽融合标签的方法主要有4 种，即化学法、内切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及自我剪切法．介绍和比较了每种方法的基本原理、应用以及研究进展．
关键词融合蛋白，多肽融合标签，标签移除，内含肽，蛋白酶
融合标签技术是利用DNA 重组技术将不同来源的基因或基因片段进行拼接，在基因水平上改造目标蛋白，产生含有融合标签的重组蛋白，不仅保持原有蛋白质的功能活性，还具有融合标签所特有的生理生化特性．随着蛋白质组学的发展及药用蛋白的研究开发，融合标签技术被广泛地应用于科研及工业领域，尤其在蛋白质分离纯化、膜蛋白结构研究、蛋白质生理功能研究等方面有着重要作用[1～3]．
虽然一些多肽融合标签能够促进目标蛋白的正确折叠和溶解，利于蛋白质的表达和定位，但是也可能对目标蛋白造成不利影响，主要表现在以下两个方面．

首先，融合标签可能会影响目标蛋白的构象．例如基因调控蛋白AreA 连接多聚组氨酸标签后，与野生型蛋白相比，虽然蛋白质的功能没有显著改变，但是蛋白质构象却发生了细微变化[4]．因此，在研究蛋白质结构时，需要移除融合标签，排除和减少融合标签对蛋白质结构的影响．
其次，融合标签可能会抑制和影响目标蛋白的活性．例如重组氨基肽酶B 的C 端连上多聚组氨酸标签后，其外切蛋白酶活性降低了近一半[5]．而对用于癌症治疗的单抗CC49单链Fv 片段(scFv)的研究表明，当多聚组氨酸标签连接于scFv 的C 端时，有可能部分覆盖scFv 抗原结合位点，从而极大地降低了scFv对抗原的结合能力[6]．因此，在研究蛋白质或酶的性质或功能时，需要充分考虑多肽融合标签的影响．对于药用蛋白质而言，融合标签不仅可能影响目标蛋白的药效，还会对人体存在潜在威胁，因而多肽标签的移除变得更为必要．
目前主要通过4种方法移除多肽标签，即化学法、内切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及基于内含肽的自我剪切法．

1 化学方法
化学方法移除多肽标签需要利用溴化氰 ( cyanogen bromide，CNBr )或羟胺( hydroxylamine ) 处理，所采取的基本策略如下：在目标蛋白与融合标签之间插入一个甲氨酸残基，诱导表达并纯化后，用溴化氰或羟胺处理所纯化的融合蛋白，使融合蛋白在插入的甲氨酸残基处断裂，从而使标签从目标蛋白脱离[7]．例如Fairlie 等[8]发展的用于生产和纯化含二硫键肽的系统就使用了溴化氰法．他们将纯化所得到的融合蛋白用溴化氰处理后，利用RP-HPLC 柱除去脱离的融合标签，结果得到纯度大于95%的目标多肽．相比于酶切法，化学法具有效率高、耗时短、成本低等优点．在上述例子中，融合蛋白用溴化氰处理4 h后切割率接近 100%．相比而言，很多酶需要长达十余小时才能达到理想的切割率．
化学法也有很多不足，例如化学法所需的反应条件容易破坏目标蛋白的结构和功能，而且所使用的溴化氰等试剂具有毒性，不适合药用蛋白的处理及研究．化学法使用的溴化氰能够使蛋白质在甲氨酸残基处断裂，如果目标蛋白含有内源甲氨酸残基，会发生非特异性断裂，导致降解和破坏目标蛋白．而且化学法切割时容易产生副反应，会对修饰一些氨基酸侧链而改变目标蛋白的特性[7, 8]．这些缺点限制了化学法在移除多肽融合标签时更为广泛的应用．

2 内切蛋白酶法
内切蛋白酶能够识别蛋白质的特殊序列，并从这段序列内部或附近的特定氨基酸残基处切割蛋白质．使用内切蛋白酶切除标签的一般策略如下： a．选择合适的内切蛋白酶，注意避免内切蛋白酶在目标蛋白内部有多余识别位点；b．构建表达载体，在融合标签与目标蛋白之间引入内切蛋白酶识别序列；c．将所构建的质粒导入宿主并诱导表达，分离纯化重组融合蛋白；d．将初次纯化的融合蛋白用对应的内切蛋白酶处理；e．再次纯化以除去内切蛋白酶及融合标签．在使用内切蛋白酶法移除融合标签过程中，需要经过两步纯化，即从细胞裂解液中纯化融合蛋白，以及将内切蛋白酶及脱离的融合标签从目标蛋白中除去．表1 列出了几种常用的内切蛋白酶。