大脑无创性检测:数字PCR技术诊断和追踪脑肿瘤

　　脑肿瘤诊断往往涉及侵袭性神经外科手术，对于临床医生而言能够在不需要活体组织检测的条件下监视脑肿瘤是一个福音，这让他们能追踪和尽早治疗恶性脑肿瘤。

　　美国马萨诸塞州总医院(MGH)研究人员研发出基于数字PCR的、检测脑肿瘤相关IDH1突变体的分子诊断方法。该公司的Xandra Breakefield博士称：“监测脑脊瘤中IDH1突变体的状态，有助于引导治疗方案的确定，从而更有效地利用医药公司研发的、针对特定突变酶的靶向药物。”

　　数字PCR技术能够无创性诊断脑肿瘤

　　马萨诸塞州总医院Fred Hochberg主管补充道：“当前的方法首先对脑肿瘤患者的脑部进行扫描，然后医生才选择活体组织检测以判断是否恶化，最终在放疗和化疗之前进行手术去除肿瘤部位。这些方案都不以肿瘤特异性突变基因为治疗靶点。”

　　Hochberg 博士在一份声明中提到：“分子诊断法能够检测脑脊瘤相关的突变基因，这有助于尽早地治疗脑脊瘤患者。而这类诊断，包括PCR检测法在内，让我们采取了避开活体检测的个体化医疗，对于一些病人而言，靶向性疗法能在外科切除手术之前缩小肿瘤体积;对于另一些病人而言，靶向性疗法能控制肿瘤生长，让患者不必要进行手术治疗，从而降低了他们的医疗开支。”

　　在研究中Breakefield博士和Hochberg博士等证实，基于数字 PCR的方法能精确地检测5位脑脊瘤患者(在8位患者之中)IDH1突变体，在其余3位患者中，检测为假阴性的2位患者有很小的肿瘤，而另1位患者的肿瘤体积是最小的。研究人员称，还需要更多的研究工作去确定肿瘤的状态和体积是否影响我们对肿瘤检测的能力。

　　此外，研究人员希望将这项研究在临床试验中得到实用，Breakefield博士称，数字PCR技术能够对脑脊瘤患者致病突变基因进行准确诊断，而这一生物标记分子有助于在避开创伤性神经外科手术的情况下监测和跟踪肿瘤。

　　脑肿瘤诊断的分子依据

　　正常细胞和肿瘤细胞都能释放出胞外囊泡，其内的RNA、DNA和蛋白片段出现在如血液和脑脊液等体液中，马萨诸塞州总医院的研究小组2008年在胞外囊泡中识别出脑脊瘤相关的大片段突变基因，但是当时的诊断技术并未从脑脊液中捕获到中枢神经肿瘤的遗传信息。

　　美国马萨诸塞州总医院Leonora Balaj解释道，肿瘤相关的标记分子在血液和脑脊液中只占很少一部分，因此具有挑战的是发现标记分子中罕见的单核苷酸突变，不过数字PCR技术能大量扩增这些难于发现的分子，从而极大地提高了对肿瘤致病突变体的检测能力。

　　BEAMing PCR和微滴式数字PCR是当前使用的两种数字PCR技术，能够对肿瘤患者和对照组的血液和脑脊液中的胞外囊泡进行分析，以检测几种肿瘤类型相关的 IDH1单核苷酸多态性。由美国马萨诸塞州总医院研制的BEAMing PCR技术经审批可用于外显子组诊断，而微滴式数字PCR技术正由RainDance Technologies公司大力市场推广。

　　诊断使用的数字PCR技术介绍

　　——BEAMing技术

　　该技术结合了数字PCR以及流式技术，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠相连接，然后DNA分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。

　　步骤1：包被链霉亲和素磁珠共价键结合的生物素标记的寡核苷酸(寡核苷酸)。

　　步骤2： PCR所需的所有成分和结合引物微球和模板DNA的水油溶液混合一起搅拌，创造微乳液。(水为白色小室，灰色为油)包含平均小于1个模板分子和小于一个微球。红色和绿色的模板代表两个模板分子，其中不同的一个或多个核苷酸的序列。

　　步骤3：微滴乳状液进行的常规PCR温度循环。如果DNA模板和微球在一个单一的水隔室中一起存在，微球结合的寡核苷酸作为引物进行扩增。连接到微球直标红色和绿色的线代表从两个不同的种模板的延伸产物。

　　步骤4：磁性分离微球(微球有磁性)。

　　第5步：变性后，将微球孵育能够区分不同种模板的序列的寡核苷酸。然后荧光标记的抗体，用于标记绑定的杂交探针。激光激发后含有PCR产物的微球能够发出红色或绿色。

　　步骤6：流式细胞仪是用来计数的红色和绿色的微球。

　　——微滴式数字PCR

　　微滴式数字PCR技术能够确定样品中待测靶分子的绝对数目，不再依赖Cq值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

　　微滴式数字PCR在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微 滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判 读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。