大鼠CFosELISA检测法

大鼠C-Fos ELISA试剂盒

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 C-Fos 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 C-Fos与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠C-Fos，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，C-Fos浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中C-Fos浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

准备试剂与收集血样

1.          收集标本：血清、血浆（EDTA）、细胞培养上清液、组织匀浆、尿液等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。

2.          标准品液配制：使用前加入0.4ml蒸馏水混匀，配成4000pg/ml的溶液。设标准管8管，每管加入标本稀释液200ul。在第一管中加入4000pg/ml的标准品溶液200ul混匀后用加样器吸出200ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出200ul弃去。第八管为空白对照。

3.          10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.         洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

标本激活方法

             1.   将450ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加10ul血清或血浆标本。

 2.   加20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60± 2分钟。

     3.   加20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。

     4.   即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数50。（注意：不同的标本C-Fos的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）

     5.   细胞培养上清或组织匀浆10倍稀释(410ul的标本稀释液＋50ul样本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

检测程序

1.          加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活）100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.          洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.          每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

8.          每孔加入100ul终止液混匀。

9.          30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.          所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.          以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、