如何关闭CRISPR基因组编辑系统中的Cas9

　　 CRISPR/Cas9技术正在如火如荼地发展。形形色色的Cas9变体被开发出，用于基因组编辑，激活和抑制基因表达，以及其他。不过，似乎还少了些什么，Cas9的活性一旦开启就无法关闭。人们担心，Cas9在细胞内停留的时间越长，脱靶编辑的可能性也越大。因此，Cas9不仅需要“开”，也需要“关”。

　　幸运的是，多伦多大学和马萨诸塞大学的研究人员的确发现了这种开关。这些anti-CRISPRs是来源于噬菌体的蛋白抑制剂，可帮助噬菌体逃避细菌的CRISPR/Cas免疫系统。它们最初是在I型CRISPR/Cas系统中发现的，但基因组编辑主要依赖II型CRISPR/Cas系统，因此对研究人员来说不是很有用。

　　2016年底，多伦多大学的April Pawluk等人在《Cell》杂志上报告称，他们在脑膜炎奈瑟氏菌（Nme）中发现了II型系统的三种anti-CRISPRs。尽管化脓性链球菌的Cas9（SpyCas9）是最常用的CRISPR系统，但脑膜炎奈瑟氏菌也可用于基因组编辑。

　　anti-CRISPRs抑制Cas9的活性

　　当这三种anti-CRISPRs在脑膜炎奈瑟氏菌中表达时，它们抑制了NmeCas9的活性。在HEK293细胞中表达时，它们也能抑制NmeCas9。对于这些实验，研究人员用三种质粒转染细胞，这些质粒分别表达：1) NmeCas9，2) sgRNA和3) anti-CRISPR(Acr)。通过T7核酸内切酶1（T7E1）分析，研究人员发现，Acr的表达使编辑从30%降低到0-10%。

　　anti-CRISPRs阻止dCas9结合

　　除了作为基因组编辑的“关闭开关”，一种anti-CRISPRs（AcrIIC3Nme）也阻止了NmeCas9与DNA的结合。为了验证这一点，研究人员在U2OS细胞中表达GFP标记的dNmeCas9与mCherry标记的dSpyCas9。当anti-CRISPR不存在时，dNmeCas9（绿色）和dSpyCas9（红色）共同出现，表现为黄色。之后，anti-CRISPR的表达便消除了绿色位点，说明它对dNmeCas9结合DNA的强力抑制。

　　anti-CRISPRs的出现让Cas9基因组编辑工具箱又多了一种工具。研究人员已经证明了它们能够抑制细菌和哺乳动物细胞中的Cas9基因组编辑，并且能够抑制dCas9与DNA的结合。现在，这些质粒已经在Addgene网站上提供。也许，它们也能为您助上一臂之力。