川大吕弋团队基于稳定同位素检测的无标记CRISPR／Cas9方法

　　CRISPR/Cas9基因编辑系统已经在基因组编辑、药物递送和基因筛选等领域得到了广泛的研究，但其潜在的脱靶效应仍然使CRISPR/Cas9的活体应用受到掣肘，也对CRISPR/Cas9的高灵敏检测和体外预筛选提出了新的要求。

　　近日，四川大学的吕弋团队提出了一种基于稳定同位素检测的无标记CRISPR/Cas9检测方法，实现了对CRISPR/Cas9的高灵敏检测和位点特异性预实验。目前报道的对CRISPR/Cas9的检测主要以放射性同位素标记、荧光染料标记和电化学标记等“标记法”为主。本次吕弋团队首次提出了一种基于稳定同位素检测的“无标记”分析方法，在实现高灵敏检测的同时，简化了分析方法，有利于快速的体外预实验进行。该方法利用基于双链DNA模板合成的无标记铜纳米粒子（dsDNA-CuNPs）代替了传统的化学标记，在保证高灵敏的检测 (LOD=0.13 nM)同时，可以在更短的时间里（35 min）完成分析的过程。

　　此外，利用CRISPR/Cas9系统的剪切和CuNPs生成对DNA底物高度的特异性,吕弋团队还进一步将这种基于稳定同位素检测的CRISPR/Cas9分析方法用在了位点特异性识别上。他们考察了前间区序列邻近基序（PAM）附件的位点突变，发现只有提供完整的PAM序列，Cas9才能成功识别并保持切割活性。另外，碱基错配导致的由于空间位阻的原因，在剪切位点处的突变也会极大程度影响CRISPR/Cas9的切割性能，这与其他位置表现的突变显示出了明显不同。通过使用不同的脱靶底物设计，这种基于稳定同位素检测的无标记Cas9分析法可以检测潜在的预期之外的切割位点，从而进一步避免脱靶效应。

　　这一研究不仅可以为CRISPR/Cas9分析提供一种快速简便的分析思路，还可以起到先验分析的作用，裨益进一步的CRISPR/Cas9基因组编辑活体研究。相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry 上。论文的第一作者为博士研究生胡建煜；论文的通讯作者为四川大学吕弋教授和刘睿副教授。近年来该课题组已开发了一系列基于稳定同位素检测的生物分析方法，用于构建高灵敏度和高准确度的生物传感平台(Chem. Commun., 2019, 55, 10665-10668； Anal. Chem., 2019, 13, 8691-8696； TrAC Trend Anal. Chem., 2018, 105, 436-452； Chem. Eur. J., 2019, 25, 12270-1227； Anal. Chem., 2018, 90, 14469-14474； Chem. Commun., 2018, 54, 13782-13785； J. Anal. At. Spectrum., 2018, 1, 57-67)。