差减cDNA文库的建立实验

［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stratagene）

TE 缓冲液EcoRIEDTA蔗糖溶液琼脂糖凝胶TBE 缓冲液乙醇S1 核酸酶S1 核酸酶缓冲液苯酚 氯仿 异丙醇乙酸钠AluIRsaI去离子甲醜胺SDS酵母 tRNA氯仿 异丙醇磷酸化的 λgt10 连接臂T4 DNA 连接酶E.coli C600flAλ 噬菌体包装抽提物悬浮介质

离心管

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 从［+］ 和 ［-］ 的细胞或组织获得 cDNA 文库。

本方案假设［＋］ 和 ［-］ 文库是 λ 噬菌体文库。如果这两种文库的载体都是质粒的话，那么它们都只需要 100 ug。插入片段需琼脂糖凝胶电泳纯化，而不仅仅是蔗糖梯度离心纯化。

2. 使用大规模的 DNA 纯化柱从［＋］和 ［-］ 文库中各纯化＞1 mg 的 DNA。以 1 mg/ml 的浓度重悬于 TE 缓冲液中。

3. 在 1.5 ml 的微量离心管中分别消化两个文库的 DNA 各 1 mg，反应如下（终体积 1.167 ml）：

1 ml 文库 DNA （1 mg）

0.117 ml 10×EcoRI 缓冲液

0.05 ml EcoRI （1000 U）

混匀，37℃ 温育 5 h。加入 40 ul 0.5 mol/L，pH 8.0 的 EDTA，65℃温育 10 min 以停止反应。进行消化的时间里，在 38 ml SW-28 管子里准备 4 个 10％～40％ 的蔗糖梯度溶液。两个管子标记为 ［＋］，两个管子标记为 ［-］。

插入 cDNA 片段中内在的 EcoRI 位点也会被切开。如果存在这种情况的话，通过这一步获得的部分长度的cDNA克隆可以被用来制作从起始 ［＋］ 文库中筛选全长克隆的探针。现在有更新的克隆位点含有如 NotI 位点的载体（如 λZAP），这类载体的出现几乎可以完全克服上述困难。

4. 每个消化产物中加入等体积的 10％ 蔗糖溶液混匀。将 ［＋］ 文库的混匀的消化产物分成两等份，小心地加到两管标有 ［＋］ 的 10％～40％ 蔗糖梯度溶液上。同样，将［-］ 文库的DNA 消化物也加到标有 ［-］的蔗糖梯度溶液上。蔗糖梯度在 20℃ 下，122 000 g （26 000 r/min， SW-28 转子）离心过夜（18～24 h）。

5. 用吸头小心移除管底的 0.2 ml 组分，其余每个组分分别放入标记好的微量离心管中，保存于 4℃。

6. 每隔一个组分取 20 ul， 在用 TBE 缓冲液配制的 1.5％ 的琼脂糖凝凝胶上分析所含的插入 DNA 片段。

7. 每管中加入 0.3 ml TE 缓冲液和 1 ml 95％ 的乙醇，混匀，置于 -20℃ 2 h 或置于干冰上 15 min， 沉淀插入的 DNA 片段。 组分中已含有沉淀 DNA 所需的足够的 NaCl。为了能够沉淀出 DNA，蔗糖梯度组分中的蔗糖必须要稀释。对于低密度组分，常常需要 1～3 倍的稀释。在高密度的组分中要高效回收 DNA ， 需要更高比例的稀释。

8. 将沉淀溶液解冻后，用微量离心管高速离心 15 min 收集 DNA。吸出并保存上清， 一直保留到回收 DNA 被检查确认后方可丢弃。每管加入 0.5 ml 70％ 的乙醇，再次离心，吸出上清，风干沉淀。

9. 重悬、合并来自 ［＋］ 文库的插入 DNA 于 TE 缓冲液中，终浓度为 0.2 mg/ml。 -20℃保存。

10. 重悬、合并来自 ［-］文库来的插入 DNA 于 100 TE 缓冲液中，置于冰上。各单独保存一小份 400 ng 的 ［＋］和 ［-］cDNA， 用作最终文库的评估。 从 1 mg 总的文库 DNA 中，预期可以回收到大于 10～15 的插入 DNA。小份的 ［＋］和 ［-］ DNA 也可以用放射性标记，用作 ［＋］文库的差异筛选探针。

11. 按如下次序混合反应体系（终体积 112 ul）， 去除 ［-］DNA 的 EcoRI 末端。

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

11 ul 10 × S1 核酸酶缓冲液

1 ul 1：500 S1 核酸酶（2 U）

涡旋混匀，离心甩至管底，37℃ 温育 30 min。

12. 加入下述试剂以终止反应：

5 ul 0.5 mol/L EDTA， pH 8.0

200 ul TE 缓冲液

300 ul 苯酚/氯仿/异丙醇

涡旋混匀，离心 1 min 分相，转移上层水相到一个新的离心管里。加入 30 ul 3 mol/L， pH 5.2 的乙酸钠，700 ul 乙醇。冷冻，然后按步骤 7、8 离心收集 DNA。沉淀重悬于 100 ul TE 缓冲液中。

13. 用 AluI 和 RsaI 将 S1 核酸酶处理过的 ［-］ 插入 DNA 消化成小片段。按如下次序混合反应体系（终体积 121 ul）：

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

12 ul 10×AluI 缓冲液

5 ul AluI（50 U）

4 ul RsaI （60 U）

涡旋混匀，离心甩至管底，37℃ 温育 3 h。加入 5 ml 0.5 mol/L， pH 8.0 的 EDTA， 65℃ 温育 10 min 以停止反应。取出 5 ml 消化产物电泳检验。

14. 加入 200 ul TE 缓冲液和 300 ul 苯酚/氯仿/异丙醇；按步骤 12 抽提，乙醇沉淀。以 1 ug/pl 的浓度重悬于 TE 缓冲液中。

15. 用 2％ 的琼脂糖凝胶（TBE 缓冲液中）电泳检査 步骤 13 中的 5 ul 消化产物，EB 染色。［-］ DNA 的消化片段应当处于 50～200 bp 之间。

16. 用 ［-］DNA 片段杂交 ［＋］ 插入 DNA。在一个 0.4 ml 的微量离心管中加入如下反应体系（终体积 51 ul）

25 ul 去离子甲酰胺（50％ 的最终体积比）

10 ul［-］ DNA 片段（10 ug）

1 ul ［+］ 插入 DNA （0.2 ，ug）

12.5 ul 20×SSC （终浓度为 5×）

0.05 ul 1 mol/L NaPO₄， pH 7.0 （10 mmol/L 终浓度）

0.5 ul 0.1 mol/L， EDTA， pH 8.0 （1 mmol/L 终浓度）

0.5 ul 10％SDS （0.1％ 终浓度）

1.0 ul 10 mg/ml 酵母 tRNA （0.2 mg/ml 终浓度）

涡旋混勻，离心甩至管底，沸水浴变性 5 min。再次轻甩离心管，37℃ 温育 18～24 h。

17. 加入 200 ul TE 缓冲液，将混合物转移到一个 1.5 ml 的微量离心管中。用 250 ul TE缓冲液洗涤杂交管后加入杂交混合物（现在的体积是 500 ul） 加入 500 ul 苯酚/氯仿/异丙醇，涡旋混匀，离心 1 min 分相。

18. 转移上清水相到一个新的离心管里。按上一步用 500 ul 苯酚/氯仿/异丙醇再抽提一次。加入 50 ul 3 mol/L，pH 5.2 的乙酸钠，1 ml 乙醇，按步骤 7、8 沉淀。沉淀重悬于 12 ul TE缓冲液。

19. 连接插入 DNA 和 λgt10（不是 λgt11）噬菌体臂。混合如下反应体系 （终体积 25 ul）：

12 ul 插入 DNA

10 ul λgt10 磷酸化的臂 （10 ug）

2.5 ul 10× 连接缓冲液

0.5 ul T4 DNA 连接酶（200 U）

用吸头上下轻轻吹吸混匀，12～15℃ 温育过夜。

20. 准备一份新鲜的 E.coli C600hflA 的过夜培养液。第二天上午，按照厂家说明，用 8～10 个商品化的 λ 噬菌体包装抽提物包装步骤 19 的连接产物。

这里使用 λgt10 载体是因为当生长在合适的宿主菌中时，它可以对重组子进行选择。10 ug λ 噬菌体载体在摩尔数上大约相当于所加入的 ［＋］ DNA的 EcoRI 末端的摩尔数。必须考虑 ［＋］ DNA 的 EcoRI 末端，即使在变性杂交后只有少部分 ［＋］ 插入 DNA 片段能被克隆。推荐的 10 ug 载体和不少于 8～10 个包装抽提物能确保很好的文库多样性。

21. 包装混合物中加入悬浮介质，一起倒入一个 5 ml 的聚丙烯管里，调整终体积到 2 ml。加入 2 滴氯仿，用手摇晃 3 s，使氯仿沉淀。

22. 按照文库的扩增方案，取 0.2 ml 和 3 ml 新鲜的 C600hfA 菌液混合， 接种于 150 mm 的平板上，总共 10 块。放置于 37℃ 培养过夜。

23. 第二天上午，取一块平板计数噬斑，所得个数乘以 10 得到文库中总得重组子。

24. 用悬浮介质洗脱板上的噬菌体或直接跳出单个噬斑筛选。

25. 评估新建的差减文库。

最好的办法是扩增文库，差异筛选两块从单个长有 20 000～40 000 个重组子的 150 mm 平板上来的尼龙膜。一块和总的 ［＋］cDNA 探针杂交，另一块和总的 ［-］cDNA 探针杂交。总的［＋］ 和［-］cDNA 探针是放射性标记的第 10 步中保存的 ［＋］和［-］cDNA。大多数克隆应当能 和［＋］ 探针杂交，而几乎没有能和［-］探针杂交。用一种蛋白探针如 actin 或 tubulin 进行杂交是不合适的，根据多种因素推测，结果是没有杂交发生（或只有很少）。