常用血细胞化学染色3

五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色

染色原理

中性粒细胞碱性磷酸酶染色的方法有Gomori钙-钻法和kaplow偶氮偶联法，因为钙-钻法操作较为繁琐且所需时间长，偶氮偶联法的试剂盒操作方便，染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法，下面介绍该方法的原理。

kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilic alkaline phosphatase, NAP)在pH 9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸荼钠底物，释放出荼酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。

试剂器材

1.10%甲醛甲醇固定液

甲醛 25mL

甲醇 75mL

混合后置4℃冰箱保存。

2.丙二醇缓冲液

(1)贮备液(0.2mol/L)

2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇 10.5g

蒸馏水 加至50O mL

溶解后保存冰箱内。

(2)应用液(0.05mol/L，pH 9.75)

0.2mol/L贮存液 25mL

0.1mol/L盐酸 5mL

蒸馏水加至 100 rnL

3.基质孵育液(pH9.5~9.6)α-磷酸荼酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20mL，再加坚牢紫酱GBC盐(或重氮坚牢蓝)20mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。

4.1g/L苏术素复染液取1g苏木素加到蒸馏水500mL中，加热煮沸，使苏木素溶解，再加入蒸馏水500mL、碘酸钠200mg、硫酸铝钾50g，充分混匀，置棕色玻璃瓶中室温保存，使用前过滤。

操作步骤

1.固定新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30~60s，待干。

2.显示把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10~15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。

3.复染置苏木素复染液复染5~8min，蒸馏水冲洗1~2min，待干，镜检。

注意事顶

1.坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是NAP染色成败的关键。

2.基质孵育液必须临用前新鲜配制。

3.所用的片子要新鲜。固定后，一般在一周内进行染色。做NAP染色时，最好选择其他患者的片子做阳性对照。

4.NAP染色以阳性率及积分报告结果。
实验评价

1.本法较钙-钻法简便、快速，色彩鲜艳，结果准确。

2.临床上NAP染色应用较广泛，但受主观因素影响较大，因此参考值变化较大。所以,NAP积分明显增高或明显减低者才有临床意义，同时要排除生理性影响(如年龄、性别、应激状态、月经周期、妊娠及分娩等)。

六、铁染色

染色原理

正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。

试剂器材

1.酸性亚铁氰化钾溶液

200g/L亚铁氰化钾溶液 5份

浓盐酸 1份

取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓滴加浓盐酸，边滴边摇匀，待烟雾消失后，过滤备用。

2.2g/L核固红-硫酸铝溶液，取硫酸铝2g溶于100mL蒸馏水中，再加入核固红0.2g。置37℃水浴中1h并随时振荡使其溶解，过滤后备用。

操作步骤

1.固定干燥骨髓涂片用甲醇固定10min，待干。

2.显示玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min蒸馏水冲洗。

3.复染置核固红液染10~15min。流水冲洗，待干，镜检。

注意事顶

1.玻片需经去铁处理将新玻片用清洁液浸泡24h，取出后反复水洗，浸入95%乙醇中24h，晾干，再浸泡在5%盐酸中24h，用双蒸气反复浸洗玻片，取出烤干后备用。

2.骨髓取材要满意，做细胞外铁时一定要有骨髓碎块或颗粒，取材不佳时，往往影响结果判断。

3.酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。

实验评价

1.铁染色是检查骨髓中贮存铁最简便有效的方法，此结果可代表全身贮存铁的情况，是诊断缺铁的重要指标之一。骨髓内如肯定有可染铁的存在，则可排除缺铁性贫血。

2.铁染色是临床应用最广泛的细胞化学染色之一。其细胞内铁易受外界铁的污染，使内铁阳性率增高；而细胞外铁虽也会受污染，但较易辨认。铁染色主要用于缺铁性贫血和环形铁粒幼红细胞增多的贫血，而对于临床不明原因的贫血做铁染色外，还应做NAP染色和PAS染色。