张玉奎院士：蛋白质组定量新技术新方法研究

中国科学院大连化学物理研究所 张玉奎院士

        2014年4月26日，首届全国质谱分析学术研讨会在北京西郊宾馆盛大开幕。来自中国科学院大连化学物理研究所的张玉奎院士为大家带来题为《蛋白质组定量新技术新方法研究》的报告。

　　通过对特定生物样本所有蛋白质在不同状态下表达的动态变化进行规模化定量分析，对于发现重要生物功能的蛋白质、筛选疾病相关的生物标志物以及寻找药物靶标等具有重大意义。张玉奎院士在报告中介绍了他在近年的研究中，发展蛋白质组定量的一些新技术新方法。

　　在样品前处理方面，研究了低丰度蛋白质的选择性富集问题，研制了多种针对糖蛋白和糖肽的选择性富集材料，张玉奎院士列举了 其中一例进行了详细解说。以参与蛋白磷酸化过程的磷酸腺苷为配基，通过提高配基的亲水性提高其对磷酸肽的选择性，并使材料制备过程简单易操作。以氨基磁球为基质，以三磷酸腺苷二钠为配体，戊二醛为交联剂，通过固载Ti4+，制备了一种粒径为200nm的基于三磷酸腺苷配基的新型固定化金属离子磁性材料。酪蛋白：血清白蛋白(1:5000)的酶解产物中仍然能够鉴定到酪蛋白的磷酸化肽。对鼠肝线粒体中磷酸化蛋白质进行分析，同商品化TiO2材料进行比较，鉴定磷酸化蛋白质数目提高了2倍，在生物学验证中，磷酸化肽的富集选择性由目前的60~70%提高到90%以上。MCM2蛋白在Hca-F细胞株中为高表达;与细胞水平的生物学验证结果一致。

　　在质谱定量分析新方法方面，发展了一种基于准等重二甲基化标记的蛋白质组相对定量新方法。在二甲基化定量方法中，由于核结合能的不同导致的质量亏损，通过高分辨率的质谱可以在MS2分辨这微小差异，进而可以在宽线性范围内实现蛋白质组的准确定量。试验使用¹³ CD₂O和NaCNBH₃实现Lys-C酶解产物的轻标记;CD₂O和NaCNBD₃实现Lys-C酶解产物在MS1的重标记。在MS1水平上两者的分子量接近等重，在MS2水平上利用碎片离子存在的5.84mDa差异即可实现蛋白质组的相对定量分析。采用该方法，定量覆盖率可以达到99%以上;定量结果与理论值相对偏差低于2%;动态范围达到2个数量级。此外，该方法可以扩展到高达6重样品的同时分析，显著提高了蛋白质组定量分析的通量。

　　在质谱数据处理新方法方面，设计了一级谱峰面积和二级谱碎片离子强度结合的定量方法。将蛋白用Lys-C酶解后分别用CH₂O标记，而还原剂选择NaCNBH₃和NaCNBD₃，两者分子量相差4Da，通过放大母离子进入碎裂池窗口实现肽段的同时碎裂。MS1有4Da差异，可以用于定量;MS/MS存在碎片离子对也可用于定量。该方法可以提高传统单一定量方法的准确度和定量覆盖率。在生物学验证中与细胞水平的生物学验证结果一致。

　　在集成化平台方面，开发了基于二甲基化标记的集成化蛋白质组定量分析平台。样品进行在线酶解后，肽段在C18捕集柱上进行二甲基化标记，并利用LC-MS/MS进行定量分析。生物学验证中，与细胞水平的生物学验证结果一致。

　　在提高新型离子源灵敏度上，张院士团队研发的新型电喷雾质谱源，与商品化离子源做对比，也能将翻译后修饰肽段的检测灵敏度提高10倍以上。

　　SDS等去除装置：张院士课题组研制的SDS等去除装置，通过中空纤维膜缓冲溶液在线交换接口，实现了盐浓度、有机溶剂浓度和PH的在线调节;可将样品中的盐浓度降低两个数量级。