搞定恒温扩增分子诊断（RPA／RAA）

分子诊断技术今日不同以往，着实借力突飞猛进，恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊的仪器设备而更受瞩目。恒温扩增方法有多种，今天就回顾RPA/RAA，让大家一文通俗搞定！

为了确保大家所认知的基本概念是一致的，请先了解以下名词解释

• 重组酶聚合酶扩增技术，RPA, recombinase polymerase amplification

• 重组酶介导的扩增技术，RAA, recombinase-aidamplification

• 重组酶，recombinase，同引物形成蛋白-核酸复合物，指导引物与模板结合，起到定位作用；帮助DNA 模板的解链和促使模板与引物之间发生链替换。

• 单链DNA结合蛋白，SSB, single stranded DNA binding。同置换出来的单链DNA结合，防止DAN配对两条链再次结合。

• DNA聚合酶，DNA polymerase，以DNA为模板，利用dNTP合成子代DNA。

• 核酸内切酶，endonuclease，可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸。
  

• Nfo，来源于细菌的核酸内切酶，且更倾向于作用于3′凹末端的双链DNA，参与DNA损伤修复。

RPA和RAA的工作原理

相同点：

• 3种关键酶或蛋白：重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶；
• 在37℃恒温下进行核酸快速扩增；

 唯一不同点：酶的来源不同，推测主要时因为ZL限制问题。

• RPA的重组酶来源于T4噬菌体；
• RAA的重组酶来源于细菌或者真菌。

下面以RPA操作原理为主进行系统的应用介绍

RPA工作原理要点：

1、在ATP存在条件下，重组酶与引物结合, 形成蛋白-核酸聚合体，并搜索配对目标；

2、当引物寻找到配对DNA模板，ATP水解供应能量，重组酶离开引物，并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA链；

3、同时，单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)同被置换出来的DNA单链进行结合，防止DNA模板再次形成双链。

RPA原理图

基于RPA方法的探针检测法

工作原理要点：

基于RPA开发的探针法

介于RPA方法胶体金层析检测法

工作原理要点：

基于RPA开发的胶体金层析法

 小结

• RPA/RAA整个反应非常速度，约30min就可以得到结果；

• 灵敏度可达10copies/ul；

• 扩增引物长度30-35bp，太短引物会影响特异性、灵敏度和扩增速度；

• 且扩增期间不需要复杂的仪器；

• 在此基础上开发的探针法或胶体金层析法都大大简化了检测结果的使用仪器，可以更好的满足不具备分子检测条件的基层或者经济较为落后的地区。