教你改善食品中防腐剂测试色谱柱的寿命

为什么防腐剂检测项目这么废柱子？

1、基质复杂，前处理简单

食品种类繁多，基本所有的食品中都含有防腐剂，果汁，饼干，糕点，酱油，肉类等性状各异，而国标食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定（GB 5009.28-2016）中的样品前处方法（下图）也比较简单，采用水提，去蛋白，过滤，离心的方法处理样品，并没有涉及去杂比较干净的SPE 方法，最终待测样品含有大量小分子杂质和颗粒物，极易污染色谱柱，导致色谱柱性能迅速下降。

不同基质的样品对色谱柱的污染程度不一样，色谱柱的寿命就不一样了，比如酱肉这种含脂肪、蛋白、色素比较多的样品，对色谱柱的污染要大于一些成分简单的果汁饮料样品。

有些检测实验室比如第三方检测单位每次检测的样品种类在变化，不同基质的样品数量也在变化，对色谱柱的污染能力也是在变化的。这也就是为什么同样一个型号色谱柱，寿命总是忽长忽短，不稳定，尤其在节假日的前后，色谱柱总是会出现问题。

2、流动相容易损害色谱柱

现在防腐剂分析主要参考GB 5009.28-2016 中的流动相条件：

流动相中含有铵盐，且有机相比例比较低（5％）对色谱柱的要求较高，损害较大。

如何改善色谱柱的寿命？

一、按照食品基质分类使用色谱柱

根据样品基质，含蛋白和其他常规样品，单独配一根色谱柱，这样就可以保证低污染样品的色谱柱寿命。也可以根据样品基质的不同设计不同的冲洗程序，更好的维护色谱柱。

二、使用保护装置

1、柱前过滤器

柱前过滤器又名预柱，放置在进样阀和保护柱之间，防止样品中的颗粒进入流路污染色谱柱。预柱由一个柱套和一个筛板组成，和保护柱最大的区别就是不含填料，只有一个具有一定孔径的筛板，常用的规格为2um和0.5um。预柱的选型与色谱柱的型号无关，只需要选择合适孔径的筛板即可。

柱前过滤器

使用过一段时间后，柱前过滤器会吸附一些杂质，这个时候系统的压力会明显升高，需要清洗柱前过滤器。清洗的时候，将柱前过滤器的筛板取下，分别放在水和甲醇中超声10分钟即可。

柱前过滤器只需更换筛板，而一个筛板成本只需几十块，可以算是最经济的色谱柱保护柱装置了，也是实验室中最容易被忽视的保护装置。在防腐剂检测项目中使用柱前过滤器可以大大降低保护柱和色谱柱受到颗粒污染的风险。

2、保护柱

保护柱

保护柱由一个柱套和柱芯组成，柱芯可以更换，保护柱芯内装填有填料，柱芯的型号跟色谱柱的型号要保持一致。

保护柱中筛板可以阻挡样品中的颗粒，保护柱中的填料可以吸附样品中的小分子杂质。保护柱算是色谱柱最全面的保镖了，清洗时间也远远短于色谱柱，价格较色谱柱也低很多，是防腐剂检测必备工具。

当系统中出现压力升高、肩峰、拖尾等异常情况时，多数情况下是由于保护柱受到污染导致

判断保护柱污染的方法：

（1）连接保护柱进一针标品

（2）取下保护柱进一针标品

对比二者谱图，若（1）和（2）峰形都不正常，则色谱柱和保护柱都受到了污染，需要分别清洗色谱柱和保护柱；若（1）峰形不正常，（2）峰形正常，则保护柱受到了污染，需要清洗保护柱。

保护柱的清洗：建议对保护柱进行单独清洗，清洗时，断开保护柱与色谱柱的连接，反向用95％水+5％甲醇冲洗，1ml/min，10分钟。

三、使用耐水的色谱柱

防腐剂流动相中的水相达到95％，普通的C18色谱柱使用一段时间后容易出现疏水塌陷的现象，表现为组分都在死时间内出峰。这个时候就需要使用一些耐水的色谱柱，CNW Athena C18-wp色谱柱键合相中嵌有极性亲水基团，大大提高色谱柱对水相的耐受，即使用纯水相流动相也不会出现疏水塌陷。

四、合理使用色谱柱

实验开始之前

防腐剂流动相中含有大量缓冲盐，为了防止盐析，每次正式实验之前一定要用95％水+5％甲醇冲洗10倍柱体积后再走方法流动相开展实验，这一点很关键，很容易被一些实验员忽视。

实验结束之后

如果第二天继续实验的话，则不需要特别清洗色谱柱，不要停泵，保持流动相处于流动状态。

如果第二天不继续实验，需要对色谱柱进行充分的冲洗，冲洗的要点就是高水相、低流速、长时间。建议按照以下方案冲洗：

95％水+5％甲醇，0.5ml/min 流速，过夜冲洗色谱柱，再过度到纯甲醇或乙腈保存色谱柱

色谱柱污染后的冲洗：

当出现拖尾、分叉等异常谱图，有时也会伴随压力上升的现象，说明色谱柱受到了污染，污染严重的色谱柱柱头填料甚至会变色。此时，色谱柱需要进行充分的冲洗。

谱图异常

柱头污染

色谱柱的污染一般发生在柱头，所以一般将色谱柱进行反向冲洗，这样污染物不需要经过整个柱体而被很快冲洗掉，冲洗色谱柱请将检测器断开以防止污染物进入检测器。

测试不同样品基质的色谱柱冲洗方法不同：

常规样品：95％水+5％甲醇，0.5ml/min过夜反冲，反冲后，正向测试

蛋白质较高样品：1％三氟乙酸：乙腈 95：5，0.5ml/min反冲过夜， 然后85％水+15％乙腈0.5ml/min反冲3小时，反冲后，正向测试