数字PCR助力新型冠状病毒药物临床试验及治疗监测

　　2019新型冠状病毒，即“2019-nCoV”，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，其中SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV均属于β属冠状病毒。

　　截止最新的确诊病例信息显示，新型冠状病毒的传播能力比SARS更强，导致疫情传播速度较快，给疾病防控工作带来极大的挑战。新冠肺炎诊疗方案（第五版）指出，呼吸道等标本荧光PCR检测新冠病毒核酸阳性是确诊方式之一。从感染到治愈，至少需3次使用PCR检测：疑似筛查、确诊、治愈出院。而受限于荧光PCR的检测能力，出现了多例假阴性，导致耽误确诊及治疗。针对2019-nCoV病毒的监测相关技术已成为应对疫情的紧急重点研究方向。其中面临最大的问题就是建立高灵敏度且定量的复核和鉴别诊断技术体系。

　　数字PCR的绝对定量能力正好可以满足这一需求。数字PCR也被称为第三代PCR技术，是一种核酸分子绝对定量技术，其核心思路是将模板分子稀释并平均分配到无数个独立反应腔室中，进行PCR扩增，通过PCR终点信号“有或无”来实现不依赖于标准曲线和参照样本的单分子绝对定量。现有的数字PCR主要以微孔或微液滴作为独立反应腔室，以微液滴数字PCR为例，其工作流程如图1所示。

图1 新羿微液滴数字PCR工作流程

　　相比于荧光PCR技术（第二代），数字PCR具有诸多优势，主要体现在以下几个方面：

　　·数字PCR的定量结果更为可靠。数字PCR是反应单元内的单拷贝核酸扩增，其定量依赖于阳性反应单元的数量（整数，呈离散分布），而非荧光强度（实数，呈连续分布）。

　　·数字PCR的定量结果更为直观和准确。荧光定量PCR（qPCR）的结果展示方式为扩增曲线，一般需要使用最大二阶导数的位置确定△Ct值，模板的△Ct值与参比的△Ct值之差仅能半定量地表示模板相对于参比的倍数关系，很难做到精确的绝对定量。而数字PCR则采用区分明显的“阴性”和“阳性”反应单元的数量来进行定量，其计数具有很高的直观性准确性。

　　·数字PCR善于在大量背景模板的干扰下对罕见的目标模板进行检测。由于背景模板被大量的反应单元所分割和稀释，在含有罕见目标模板的反应单元中，背景模板的数量被呈数量级地减少了（比如将PCR体系分割为10000个反应单元，则每个反应单元内的背景模板的数量被减少4个数量级），因此PCR扩增时目标模板受到的非特异性干扰也呈数量级地减少，从而保证这些罕见的目标模板的有效扩增。

　　·数字PCR对抑制剂的抗性大大增强。类似于上述讨论，由于抑制剂的分子数量被大量的反应单元所分割和稀释，在含有模板的反应单元中，抑制剂的分子数量被呈数量级地减少了，因此PCR扩增时目标模板受到的抑制剂的干扰也呈数量级地减少，从而保证模板的有效扩增。

　　综上所述，数字PCR技术相比于前两代PCR技术，是一项可靠、精准和直观的核酸扩增和检测方法，尤其适用于复杂样本中目标核酸拷贝数的定量。在新型冠状病毒的检测中将发挥如下重要作用：

　　① 用于有接触史尚无症状者排查：基于数字PCR的高灵敏度，检测病毒携带状况；

　　② 用于新型冠状病毒疑似患者诊断复核：基于数字PCR的高灵敏度和高准确性，可用于荧光PCR的Ct值在37-40之间的可疑样本判定。

　　③ 用于新型冠状病毒感染患者病毒载量动态观察：基于数字PCR的绝对定量能力，无需依赖标准物质即可可为临床医生提供更为准确的病原体载量信息，协助判断病情并及时调整治疗策略。

　　④ 可用于治疗后患者体内病毒转阴的复核，用于指导出院。

　　⑤ 标准参考物质的制备：数字PCR是制备标准参考物质定量的重要方法，为荧光PCR试剂盒提供可靠的标准物质。

　　《中华医学杂志》2020年2月11日刊登的《新型冠状病毒肺炎病毒核酸检测专家共识》中指出，及时对急重症及疑似患者进行诊断需要快速有效的方法，病毒核酸检测可为诊断提供直接证据。当qPCR检测判读为“可疑”结果时，实验室应考虑“更换不同厂家的试剂盒重复实验或采用敏感度更高的方法，如数字PCR方法进一步确定”。

　　新羿TD-1 数字PCR系统：

　　新羿TD-1数字PCR系统由Drop Maker 样本制备仪和 Chip Reader 生物芯片分析仪及其他相关试剂耗材构成。

　　产品优势：

　　◇ 超敏：灵敏度低至0.01%；

　　◇ 便捷：操作简单，无须手动移液；

　　◇ 可靠：多重防污染，避免假阳性；

　　◇ 开放：支持个性化检测项目开发。

　　产品资质：

　　公司在中国疾病预防控制中心指南的指导下，开发了基于数字PCR的创新一步法2019-nCoV核酸检测试剂盒。

新羿生物新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸定量检测试剂盒

　　产品优势：

　　◇ 灵敏度高：最低检测下限 100copies/mL；

　　◇ 定量准确：无需标准品和标准曲线；

　　◇ 快速检测：2小时即可完成核酸样本检测；

　　◇ 操作简便：一步上样，操作简单，微液滴生成后无需转移，人为误差小；

　　◇ 封闭检测：全封闭体系检测，防止气溶胶污染和样品损失，预防假阳性；

　　◇ 特异性好：与其他常见呼吸道病原体（病毒、细菌、真菌）无交叉反应。

　　样本类型：

　　◇ 上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液；

　　◇ 下呼吸道标本：包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本；

　　◇ 其他：血液标本、血清标本、组织培养物等。

　　该试剂盒目前在北京协和医院、军科院、北京地坛医院、浙江大学第一附属医院等重点医院、重点实验室已完成近500例临床验证，性能优异。

　　本产品已于2020年2月3日入选中关村首批抗击疫情新技术新产品新服务清单。

　　订购信息：

　　本项目面向临床实际需求，在当下疫情中具有重要的临床应用前景，为疫情的防控提供优秀的解决方案。新羿生物与奋战在疫情前线的医护英雄们一起，携手共渡难关！