方案2分析之前或之后对磷酸化多肽进行碱性磷酸酶处理

磷酸化多肽样品在溶液中保存

乙腈碱性磷酸酶甲酸MALDI 基质三氯乙酸

台式离心机去盐树脂MALDI 靶板质谱仪塑料盒加样吸头注射器

方法 A: 在 MALDI-MS 分析之前在溶液中去磷酸化的方法

1.根据方案 1 中的附加方案，准备两个 nanoscale 去盐柱子（PorosR2 或 PorosR3)。在孵育期间，用 5% 的甲酸保证树脂湿润（第 3 步），GELoader? 吸头的上端作为一个反应室。

2.在每一个反应中，加 20ul 碱性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中，然后再稀释 1~2ul 的多肽样品到碱性磷酸酶溶液中（最后反应溶液的 PH 为 8 左右，必要时用 50 mmol/L NH4HCO3 进行调整，也可以用 pH 试纸检测）。

要点：准备一个对照反应，GELoader 吸头中含有 50 mmol/L NH4HCO3, 同时加入与上述等量的多肽，无碱性磷酸酶。

3.GELoader 吸头于 37°C 孵育 45 min，使多肽去磷酸化。

4.加入 2ul 15% 的甲酸，酸化样品，通过注射器施压把样品加到 Poros 树脂上。

5.用 20ul 5% 的甲酸洗涤柱子，然后再用 1ul 饱和的 MALDI 基质洗脱柱子，为得到较好的敏感性，把洗脱液按 5?8 小滴加到 MALDI 板上，第 1、2 滴是主要分析的组分。

6.分别记录从第⑤步中得到的样品及对照组样品中的一部分磷酸化多肽的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 线性-TOF 谱图。

方法 B:MALDI-MS 分析后在溶液中去磷酸化

此法对于 DHB 和 CHCA 两种 MALDI-MS 基质都适用。

1.根据方案 1 中的附加方案，准备两个 nanoscale 的去盐柱子（poros R2 或 Poros R3)。在孵育期间（第④步），用 5% 的甲酸保证树脂潮湿。

2.用 GELoader 吸头的上端作为一个反应室。在每一个反应室中加 204 碱性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中。

要点：准备一个对照反应，GELoader 吸头中含有 50 mmol/L NH4HCO3。

3.记录多肽混合物的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 线性-TOF 图谱。

4.用微量加样器取0.5~1.5ul 的 70% 乙腈+0.05mol/L NH4HCO3 小心溶解分析物/基质结晶，把等体积的溶解的分析物/基质结晶直接转移到每一个反应室里。

为成功得到分析图谱，不锈钢表面的 MALDI 板必须是「磨光」的或是 AnchorChip0

5.GELoader 吸头在 37°C 孵育 45 min，使多肽去磷酸化。

6.加人 2 倍体积的 5% 的甲酸，酸化样品，通过注射器施压把样品加到 Poros 树脂上。

7.用 20W5% 的甲酸洗涤柱子，用 1ul 饱和 MALDI 基质洗脱柱子，为得到最佳的敏感性，把洗脱液按 5~8 小滴加到 MALDI 靶板上，第 1、2 滴是主要分析的组分。

8.记录碱性磷酸酶处理的多肽的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 线性-TOF 谱图

方法 c: MALDI-MS 分析后在靶板上去磷酸化

此方法仅适用于 CHCAMALDI-MS 基质。

1.分析分析物/基质结晶中得到 MALDI 反射-T0F 和 MALDI 线性-TOF 谱图后，用 1.5ul 含有 0.05U/ul 碱性磷酸酶的 0.05mol/L NH4HCO3 溶液在靶板上溶解基质。

2.将靶板放置于一个封闭的塑料盒中，盒中放置湿的织物，以防样品干燥，37°C 孵育 30 min。

3.用 0.5ul 5% TFA 酸化样品，这样是为了使基质再结晶。

4.在 MALDI 分析去磷酸化多肽之前，用 0.1% TFA 轻轻洗涤基质微晶体的表面，以洗掉来自去磷酸化缓冲液中的盐分和甘油，将 10ul 0.1%TFA 滴到基质上，静置片刻后迅速用织物的边缘去除 TFA 溶液。