核酸凝胶电泳4

5、室温下聚合至少30min，若聚合完全，梳齿下可见二条折光线，小心拔出梳子，用水冲洗样品孔。
6、在电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔，并用缓冲液稍淋洗样品孔。
7、加上1/6体积6×上样缓冲液与DNA样品及DNA分子量标准液中混合，用微量进样器吸取，小心快速地加入加样孔中（一般加样量3~5μl）。
8、接上电极，以5V/cm（1~8V/cm）的电压进行电泳。
9、参照染料迁移至所需位置时，切断电源，取出凝胶床，小心撬去上面的玻璃板，检查凝胶是否完好地附在下面的玻璃板上，按下列方法之一进行染色或显影，检测DNA的位置：
①溴化乙锭染色法：聚丙烯酰胺凝胶能抑制EB的荧光量，故用该法时，DNA量须大于10ng，将凝胶和玻璃板一起放入含0.5μl EB的1×TBE缓冲液中，30~45min后取出，水洗，紫外灯下观察并照相。

②银盐染色法：灵敏度很高，适用于聚丙烯酰胺凝胶中DNA和RNA的染色。凝胶先在50%甲醇、10%乙酸中浸泡30min；50%甲醇、7%乙酸中30min；10%戊二醛中固定30min；用水洗去多余的固定剂，然后用0.1%硝酸银浸泡30min，在100ml 3%碳酸钠（含50μl甲醛）中显影，直到获得满意效果。加5ml 2.3mol/L柠檬酸，搅动10min，即可中止反应，用ddH2O洗涤30min后浸在0.03%碳酸钠溶液中泡10min，置封闭口袋中保存。
【注意事项】
1、凝胶以1×TBE缓冲液并以低电压1~8V/cm电泳，同时凝胶应尽可能薄，以防电泳时产热过大，引起DNA变形，导致出现“微笑”DNA区带。
2、Acr是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收并具有累积性，操作时必须戴手套和口罩。
3、核酸的PAGE通常采用连续系统，没有浓缩阶段，因此核酸样品体积不能太大。
方案二 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
【原　理】
变性聚丙烯酰胺凝胶，用于分离和纯化单链DNA（RNA）片段，这类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在的情况下聚合而成的，DNA的迁移率和碱基的组成及序列无关，故可用于分离同位素标记的探针、分析SI核酸酶的产物和DNA测序等。变性PAG常用于：①测定双链DNA的长度；②回收寡核苷酸。此方法迅速、简单、分辨率高，虽然产量较低（<50%所加样品），但也足以满足大部分工作的需要。
【试剂及配制】
1、5×TBE（见方案一）
2、42%丙烯酰胺
丙烯酰胺 40g
甲叉双丙烯酰胺 2g
加双蒸去离子水至100ml。
3、TEMED
4、尿素
5、10%过硫酸铵（AP）
6、2×甲酰胺上样缓冲液
5×TBE 0.2ml
去离子甲酰胺 0.9ml
10%溴酚蓝 50μl
7、0.3mol/L乙酸钠（pH7.5）
8、TE缓冲液（pH8.0）（10mmol/LTris-Cl、1mmol/L EDTA）
【操作步骤】
1、制备PAG-尿素凝胶，按寡核苷酸长度选择适当浓度的凝胶（12%、15%、19%的尿素丙烯酰胺浓度分别对应被分离合适的寡核苷酸长度40~100、25~40、<25nt）。按下列混合：25.2g尿素（终浓度7mol/L），12ml 5×TBE，42%丙烯酰胺（所需量），加水至60ml，加10% AP 200μl和TEMED 30μl，混合并倒胶（避免气泡产生），在室温下聚合30min以上。
2、取出梳子，安装电泳装置，在电泳槽中加入1×TBE。1500V电压预电泳15~30min。
3、用等体积的2×甲酰胺上样缓冲液稀释样品（上样前可在90℃加热3min以除去二级结构的干扰），产生清晰的带需要10μg寡核苷酸。
4、用TBE冲洗上样孔数次洗净尿素，上样。
5、1500V电压进行电泳，当溴酚蓝迁移至凝胶底部时，停止电泳。
6、卸下玻璃板，水平放置，撬起上面的玻璃板，用保鲜膜盖住凝胶，翻转玻璃板，取出底面的板，同样用保鲜纸盖住。
7、在短波长紫外灯下观察，用干净刀片切下所需的DNA条带，将凝胶条放到小离心管中。
8、每2cm的凝胶小条加0.5ml 0.3mol/L乙酸钠，室温下在摇床中洗脱过夜。
9、将溶液转移到另一干净管中，避免吸取凝胶碎片。用酚、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀，干燥样品后再重悬于ddH2O或TE中。
【注意事项】
1、预电泳是为了使AP迁移出样品孔，并将凝胶加温至最适于DNA电泳的温度。
2、第7~9步为了回收DNA的方法。