核酸提取那些事儿

最近有篇报道“Nucleic acid purification from plants，animals and microbes in under 30 seconds”即利用试纸条30秒内纯化动物、植物和微生物的核酸，发表在PLoS Biology期刊上，引起热议，故对现核酸提取扩增尽己所能进行总结。

核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点与相似的理化特性。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。

核酸提取前提需进行核酸裂解释放，经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸，也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的。

在细菌、植物等富含多糖样品的基因组抽提中，裂解液中常含 CTAB ，CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键；质粒抽离一般采用SDS 碱裂解法；高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，替代传统抽提 RNA 的首选方法，传统的trizol结合氯仿，对人体损伤较大，渐渐被弃用。

        PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法，正如文献报道：将叶子组织浸入到含有500μl细胞裂解液（20 mMTris [pH 8.0]， 25 mMNaCl， 2.5 mM EDTA， 0.05% SDS）和两个滚珠的试管中。再把试纸条浸入到叶子组织的粗提液中来结合核酸，随后又让它浸入到清洗液中（10 mMTris [pH 8.0]， 0.1% Tween-20），最后将它浸入到扩增反应液中，从而结合到它上的核酸洗脱下来，并将扩增反应液转移到一台热循环仪中进行扩增反应。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。同时由于不纯化，往往含有大量抑制 PCR 的物质，比如牛奶中含有较多乳铁蛋白，全血 ( 或血清、血浆 ) 中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素，土壤中含有较多腐殖酸等。这些物质会强烈抑制 DNA 聚合酶的活性，使 PCR 失效，导至假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。为了提高检出率需要加入高耐受 DNA 聚合酶 (AlphaTaq)及多种PCR增强剂。该方法最简单的就是反复冻融法，简便快捷，不需任何化学试剂，冻融离心，PCR检测就可以了。如果使用裂解法，哪么最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等，能大大减少操作步骤，大幅度提高检测速度，节省成本。