植物基因组提取试剂盒使用说明

试剂盒内容及保存：

储存条件和效期：

本试剂盒在室温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于2–8℃。2–8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。单独包装的RNaseA收到后-20℃保存。

产品简介：

本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，能提取多种植物细胞/组织中的基因组DNA。离心吸附柱可以高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。

使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

提取得率：

准备工作：

1. 准备液氮；65℃水浴；无水乙醇；1.5ml灭菌离心管。

2. 按照标签所示在缓冲液AP3和漂洗液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液AP1，缓冲液AP2和缓冲液AP3是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 取适量植物新鲜组织500mg-1g加入液氮充分研磨，取约100mg粉末置于1.5ml离心管中，加入400 μl 缓冲液AP1和6 μl RNaseA (10mg/ml)，漩涡震荡1分钟。

2. 将离心管放在65℃水浴10分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3. 加入130 μl 缓冲液AP2，颠倒混匀，冰浴5分钟。

4. 12,000rpm离心5分钟。

注：此步骤离心去除去垢剂，蛋白以及多糖等杂质。

5. 取上清（通常为400 μl）转移到过滤柱CF中，12,000rpm 离心1分钟。

6. 将滤出液转移到1.5 ml离心管中，加入1.5倍体积（例如400 μl的上清液加600 μl缓冲液AP3）缓冲液AP3（使用前请注意是否已经加入无水乙醇），立即颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

7．吸取步骤6中的混合液加入到吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放回收集管中。

注：离心吸附柱的最大容积是700μl，如果一次不能完全上柱，可以分次上柱离心，保证全部溶液全部加到离心柱中。

8．向吸附柱CG中加入500 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

9．重复步骤8。

10. 可选步骤：如果离心柱的吸附膜上有颜色，向吸附柱CG中加入500 μl无水乙醇，12,000 rpm离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

11．将吸附柱CG放回废液收集管中，12,000 rpm离心2分钟。

注：此步骤非常重要，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

12．将吸附柱CG转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 μl经65℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000 rpm g离心2分钟。

注；1. 洗脱缓冲液体积最好不少于50 μl，体积过小影响回收效率。

2. 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

13.  DNA产物-20℃保存。

DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。